过表达山羊Nramp1细胞株及在抗菌研究中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种获得过表达山羊Nramp1基因细胞株的方法及该种细胞株在抗菌研究中的应用。通过慢病毒表达系统等手段，获得了过表达山羊Nramp1的山羊精原干细胞株(oeNramp1

【技术实现步骤摘要】
过表达山羊Nramp1细胞株及在抗菌研究中的应用


[0001]本专利技术公开了一种获得过表达山羊Nramp1基因细胞株的方法及该种细胞株在抗菌研究中的应用，属于生物


技术介绍

[0002]近年来，研究宿主和病原体之间的动态相互作用对于我们理解疾病过程至关重要。天然抗性相关巨噬细胞蛋白1基因(nature resistance associated macrophage protein 1 gene, Nramp1)，是溶质转运家族成员，也被称作溶质转运载体(solute carrier 11a1, Slc11a1)，在小鼠巨噬细胞中对抵抗病原体起着关键性作用。例如：各种分枝杆菌（Mycobacterium lepraemurium)、沙门氏菌(Salmonella)血清型、牛分枝杆菌(M.bovis)、胞内分枝杆菌(M. intracellulare)和杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani）等。在巨噬细胞中，NRAMP1主要表达于吞噬溶酶体的细胞器膜上，并在感染的早期阶段通过运输Fe
2+
使吞噬体内的铁含量减少，来限制胞内菌对铁的利用从而增强巨噬细胞抵抗病原体的能力。Nramp1参与了宿主应对病原体的先天免疫反应，过去30年的研究已确定Nramp1是宿主对抗细胞内病原体(牛分枝杆菌和鼠伤寒沙门氏菌)敏感性的主要调节因子。在小鼠中，功能性Nramp1的缺失导致细菌在肝脏和脾脏中的复制不受限制，最终导致致命感染。在人类中，Nramp1的遗传多态性与多种细菌性疾病相关，包括结核病和麻风病，以及炎症性肠病和类风湿性关节炎。山羊Nramp1基因全长1647 bp，定位于山羊2号常染色体长臂q12.2。在山羊各个组织中，Nramp1主要分布于肝脏和脾脏，在其他组织中表达量很少或基本没有表达，其中，脾脏中的表达量最高。本专利技术在已有基础上，建立了一种获得过表达山羊Nramp1基因细胞株的方法并探究了过表达Nramp1在细胞增殖以及挽救LPS引起细胞凋亡的功能。本专利技术具有创新性强、新颖性高、安全性好等特点，为后续抗菌研究提供了可靠的技术平台。

技术实现思路

[0003]一、名词定义。
[0004]本专利所指Nramp1(nature resistance associated macrophage protein 1 gene)，亦称为Slc11a1。山羊Nramp1基因全长1647 bp，定位于山羊2号常染色体长臂q12.2。在山羊各个组织中，Nramp1主要分布于肝脏和脾脏，在其他组织中表达量很少或基本没有表达，其中，脾脏中的表达量最高。NRAMP1是一种定位于巨噬细胞和中性粒细胞溶酶体和内吞体膜上，将二价金属阳离子(铁、锌和锰)从内吞体或溶酶体内部转运到细胞质，以交换H
+
。这种转运形式可以使吞噬体内细菌缺乏这些二价金属离子，并通过输入H
+
使溶酶体酸化向吞噬溶酶体演变，完成对细菌的裂解。
[0005]本专利所使用的山羊精原干细胞株(mGSCs)和小鼠巨噬细胞株(Raw264.7)由陕西省干细胞工程技术研究中心所保存使用。
[0006]本专利所使用的慢病毒表达系统由：pCDH
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copGFP
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T2A
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Puro、PAX2、pLP/VSVG所组
carrier 11a1, Slc11a1)，在小鼠巨噬细胞中对抵抗病原体起着关键性作用，然而有很少的研究就其调控机制进行报道，本专利技术通过构建过表达山羊Nramp1细胞系，为后续探索研究其机制提供可靠平台，同时为抗病育种工作奠定基础。
[0013]2) 从实际的数据来看，在mGSC细胞中，过表达山羊Nramp1，能够提高细胞的免疫应答能力，特别是对JAK
‑
STAT通路的影响。同时降低细胞内炎症因子的表达水平。
[0014]3) 从实际的数据来看，在Raw264.7细胞中，过表达山羊Nramp1，在沙门氏菌LPS刺激下，其凋亡水平较对照组显著下降，能够挽救细胞的炎症反应。
[0015]综上所述，构建过表达山羊Nramp1细胞系，对于探究胞内菌与宿主互作效应，以及胞内相应病原刺激的相关通路来说，是一个良好的研究平台，为将来生产具有优良性状的抗病山羊等疾病模型奠定了基础。
附图说明
[0016]图1为鉴定过表达细胞株结果，其中A图为在mRNA水平检测了Nramp1表达量的结果，RT1和RT2 分别代指不同的引物对，B图为在蛋白水平检测了Nramp1的表达情况，过表达细胞株的Nramp1表达水平显著高于对照组；C图为过表达细胞株在荧光显微镜下的形态图片；D图为测量过表达细胞株细胞生长曲线图，其中mGSC
‑
oeNramp1相较于对照组群体倍增时间显著缩短。表明oeNramp1能够使mGSCs细胞株增殖能力变强。综上的结果：表明我们成功获得了过表达山羊Nramp1的mGSCs和Raw
‑
264.7细胞株。
[0017]图2为用200 ng/mL沙门氏菌LPS刺激Raw
‑
oeNramp1细胞株流式分析结果以及mGSC
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oeNramp1 RNA
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seq分析结果。在细胞流式图中，对照组Raw
‑
pCDH在200 ng/mL沙门氏菌LPS刺激下，细胞凋亡率为33.32%（早凋亡率为28.14%+晚调亡率5.18%）；而Raw
‑
oeNramp1在200 ng/mL沙门氏菌LPS刺激下，细胞凋亡率为10.33%（早凋亡率4.11%+晚凋亡率6.22%），结果表明过表达Nramp1的Raw264.7能够减少沙门氏菌LPS引起的细胞凋亡率。表明这种细胞系能够成为研究胞内菌感染相关通路的潜力，为后续抗菌研究提供了可靠的技术平台。RNA
‑
seq分析结果显示：在mGSC
‑
oeNramp1细胞株中，其差异基因总计3353个，上调基因2021个，下调基因1532个。火山图显示SLC11A1(Nramp1)mRNA水平较对照组上调了2
7.5
倍，即181倍。GO富集分析结果显示上调基因大部分富集到了抗病毒、应对病毒反应过程、抗原呈递、宿主防御等生物学过程，表明过表达Nramp1能够提高mGSCs细胞的免疫应答能力。除此之外热图中展示的STAT1、STAT2、IRF9、STAT6、SOCS1、SOCS2、ISG15、ISG20属于JAK
‑
STAT通路，该通路是许多调节细胞生长、分化、存活和病原体抵抗信号通路中的关键部分，其在应激炎症中也起到了关键作用。有趣的是：IL6、IL
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12A、IL
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12B、IL
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1B这些促进炎症的细胞因子mRNA水平被下调。
[0018]具体实施方式：1.山羊Nramp1 改造后CDS序列 (NM_001285694本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.本发明提供了一种获得过表达山羊Nramp1基因细胞株的方法，首次在山羊精原干细胞系（mGSCs）和小鼠巨噬细胞系（Raw264.7）中过表达山羊Nramp1，完成了mRNA水平和蛋白水平细胞株鉴定，设计实验验证了oeNramp1有显著的抗菌能力。2.如权利要求1所述的过表达山羊Nramp1细胞株，其特征如下：1) 过表达山羊Nramp1细胞株分为：mGSC
‑
oeNramp1、Raw
‑
oeNramp1；2) 在mGSC
‑
oeNramp1细胞株中，Nramp1较对照组其mRNA水平，在RT
‑
PCR检测上调了120倍，RNA
‑
seq数据显示其mRNA水平较对照组上调了181倍；3) 在mGSC
‑
oeNramp1细胞株中，Nramp1较对照组其蛋白水平上调了约1.5倍；4) 在Raw
‑
oeNramp1细胞中，Nramp1较...

【专利技术属性】
技术研发人员：华进联，陈文博，万仕成，张梦菲，杨栋慧，王聪亮，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：