一种基于准均相反应的比率型双极电极电化学发光生物传感器及其应用制造技术

本发明专利技术公开一种基于准均相反应的比率型双极电极电化学发光生物传感器及其应用。通过采用HNCQDs/H2O2体系和Ru(bpy)

【技术实现步骤摘要】
一种基于准均相反应的比率型双极电极电化学发光生物传感器及其应用


[0001]本专利技术涉及一种准均相反应的比率型双极电极电化学发光生物传感器用于miRNA
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222检测，属于生物传感
，该生物传感器基于双阳极ECL信号强度的变化，通过信号比值，从而实现对血清中miRNA的超高灵敏度检测分析。

技术介绍

[0002]微小核糖核酸（Micro
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ribonucleic acid，miRNA）是一种长度通常为18 ~ 23个核苷酸的非编码内源性核糖核酸，在不同的基因间区内发挥着重要的调控作用。目前，miRNA常作为生物标志物用于癌症的诊断，研究其体内表达水平可作为判断癌症发生发展情况的依据。其中miRNA
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222表达水平的升高是诸多癌症发生的危险因素，包括甲状腺癌、乳腺癌、前列腺癌等。同时，miRNA
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222能够调节靶蛋白，增强肿瘤的耐药性，主要是由外泌体中miRNA参与调控药物靶蛋白的表达，促使癌细胞产生耐药性，导致血浆中药物浓度升高，影响临床治疗效果。因此，准确分析miRNA
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222的表达水平，不仅有助于癌症的早期诊断和预后评估，还能对癌症治疗与预后过程中的临床用药提供可靠的指导意见，进而提高临床用药的治疗效果，保障患者的用药安全。然而，外泌体中的miRNA丰度低，难以检测，因此迫切亟需开发具有超高灵敏度的miRNA检测手段。
[0003]电化学发光（Electrochemiluminescence，ECL）技术具有低成本、操作简便、不需要昂贵的仪器设备等优势，可用于构建即时检测装置。同时，采用比率型ECL策略，可通过两个ECL信号之间的自校准，有效避免来自外界环境的干扰，进而提升结果的准确性。闭合式双极电极（Bipolar electrode，BPE）能够在空间上有效隔绝两个电解池溶液间交换，避免复杂的分析环境；同时，基于电中性原理，整个闭合式BPE遵循电子守恒定律，两电解池发生的氧化还原反应是相互关联。因此，基于双极电极结合比率型电化学发光技术构建的生物传感器（比率型BPE
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ECL生物传感器）在生物分析领域具有独特的优势。
[0004]目前，开发的多数基于BPE
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ECL生物传感器，通常是需要将核酸识别探针固相修饰在芯片表面，固相修饰步骤会改变识别探针的构象，同时整个生物识别过程都是在异相界面上进行，存在空间位阻效应，降低目标物与核酸识别探针之间的杂交效率，在一定程度上限制了传感器对miRNA检测灵敏度。一些核酸分子免固定的均相ECL方法受到广泛关注，其中以Fe3O4磁性纳米颗粒（Ferroferric oxide magnetic nanoparticles，Fe3O4NPs）为代表的磁性纳米材料，因其独特的磁分离特性，能够高效、无残留地从均相或准均相反应体系中分离目标物，在生物分析和疾病诊断领域展现出广阔的应用前景。因此，将BPE
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ECL生物传感器与磁性纳米材料相结合，有望进一步提升传感器灵敏度，并且得益于磁性材料可磁分离的特点，构建的BPE芯片能够重复使用，降低成本，减小实验误差，提高结果重现性。
[0005]在对复杂生物样本中低丰度的miRNA检测中，对传感器性能提出更高要求，通常采用信号放大策略来进一步提升传感器的灵敏度。近年来，规律间隔成簇短回文重复序列（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）和CRISPR相
关蛋白Cas构成的CRISPR/Cas体系作为一种新技术在生命科学领域备受关注。同时，核酸扩增技术在临床检测领域的应用越来越广泛，其中包括环介导等温扩增、滚环扩增以及聚合酶链式反应等。然而，这些核酸扩增方法是基于聚合反应，容易产生非特异性扩增，在实际操作中存在检测结果假阳性的风险。而连接酶链式反应（Ligase chain reaction，LCR）基于两组DNA探针（四根DNA探针）对目标物进行识别，具有特异性好、背景低、灵敏度高等特点。基于LCR的扩增原理，两种探针与目标miRNA先通过碱基互补配对结合，当完全互补时连接酶特异性连接DNA探针，在这个过程中将miRNA间接逆转录为长链DNA模板。此后，基于DNA模板与探针互补进行热循环扩增，其中只有完全互补的结构才能被连接酶连接。因此，LCR技术能够识别单碱基差异并实现指数级扩增核酸。
[0006]本专利技术公开一种基于准均相反应的比率型双极电极电化学发光生物传感器用于miRNA
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222检测。采用选用Ru(bpy)
32+
/TPrA体系和HNCQDs/H2O2体系为双阳极ECL信号源，引入LCR与CRISPR/Cas12a技术作为核酸扩增技术与信号放大策略，结合Fe3O4NPs作为信号探针反应界面，构建一种miRNA
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222的比率型BPE
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ECL检测新方法。在Fe3O4NPs表面原位还原生成金纳米粒得到Au@Fe3O4NPs，将标记二茂铁（Ferrocene，Fc）的信号探针DNA
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Fc，通过Au
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S键富集于Au@Fe3O4NPs表面作为信号单元。与第一章相同，Ru(bpy)
32+
/TPrA体系在驱动电极阳极发光（ECL
Ru
），HNCQDs/H2O2体系在BPE阳极发光（ECL
HNCQDs
）。将DNA
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Fc/Au@Fe3O4NPs通过磁吸附富集在驱动电极阳极，修饰的Fc对ECL
Ru
信号产生猝灭作用。然后，通过磁性吸引，让DNA
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Fc/Au@Fe3O4NPs转移至BPE阴极区，Fc作为一种电化学活性物质，同时还具有优良的导电性能，能够加速BPE芯片的电子传递速率，增强ECL
HNCQDs
。设计LCR反应对目标miRNA
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222进行扩增，扩增产物能够被crRNA识别，激活CRISPR/Cas12a系统的非特异性切割活性，裂解DNA
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Fc信号探针，Fc数量减少，猝灭作用减弱，ECL
Ru
信号恢复。同时，BPE芯片的电子传递速率降低，导致ECL
HNCQDs
信号削弱。基于两个ECL体系的信号比值变化，实现对miRNA
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222的检测分析。其中LCR扩增与CRISPR/Cas12a体系都是在均相溶液中发生，能够高效识别目标分子。构建的比率型BPE
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ECL传感器表现出超高的灵敏度、良好的稳定性与重现性。用于人血清样品中miRNA
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222的检测具有良好的表现，在体外分析与临床医疗领域中有着巨大的应用潜力。

技术实现思路

[0007]1. 本专利技术的目的是提供一种基于准均相反应的比率型双极电极电化学发光生物传感器及其本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于准均相反应的比率型双极电极电化学发光生物传感器，其特征在于，所述的生物传感器包括信号探针修饰的磁性纳米材料（DNA
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Fc/Au@Fe3O
4 NPs）、连接酶链式反应与CRISPR/Cas技术联用中所需的酶与试剂、双阳极ECL发光探针以及共反应剂、基于ITO和PDMS构建的双极电极芯片、阴极池中所包含的核酸探针和试剂，所述的生物传感器能用于miRNA
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222的超高灵敏度检测。2.根据权利要求1所述的一种基于准均相反应的比率型双极电极电化学发光生物传感器，其特征在于，所述的双阳极ECL发光探针以及共反应剂为HNCQDs/H2O2体系和Ru(bpy)
32+
/TPrA体系。3.根据权利要求1所述的一种基于准均相反应的比率型双极电极电化学发光生物传感器，其特征在于，所述的信号探针修饰的磁性纳米材料（DNA
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Fc/Au@Fe3O
4 NPs）浓度为2.5 ~ 10 mg/mL，其制备方法包括如下步骤：（1）Au@Fe3O
4 NPs的制备：在微沸的5 mL浓度为0.04 wt%的HAuCl4溶液，加入500 μL Fe3O
4 NPs，溶液再次沸腾后，加入100 μL 浓度为5 wt %柠檬酸钠溶液，原位还原生成金纳米粒，当溶液的颜色从棕色变成紫色，最后变成红色说明生成金纳米粒，继续加热15分钟后，经磁分离，用超纯水清洗三次，重分散于500 μL超纯水，得Au@Fe3O
4 NPs；（2）DNA
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Fc/Au@Fe3O
4 NPs的制备：将200 μL的10 μM DNA
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Fc与200 μL步骤（1）制得的Au@Fe3O
4 NPs混合，DNA
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Fc通过Au
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S键与Au@Fe3O
4 NPs连接，pH 7.4下，振摇过夜；而后，加入200 μL 2 wt% BSA溶液，振摇1 h，封闭非特异性位点，通过磁洗，分离剩余的DNA
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Fc，清洗三次后，重新分散于200 μL超纯水中，即得DNA
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Fc/Au@Fe3O
4 NPs。4.根据权利要求1所述的一种基于准均相反应的比率型双极电极电化学发光生物传感器，其特征在于，所述的双极电极驱动电压为0 ~ 4 V。5.根据权利要求1所述的一种基于准均相反应的比率型双极电极电化学发光生物传感器，其特征在于，连接酶链式反应与CRISPR/Cas技术联用中，用于检测miRNA
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222的核酸探针包括：（1）Probe X1，序列：5'
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【专利技术属性】
技术研发人员：雷云，刘爱林，张子阳，张宇，程章健，韩舒桦，
申请(专利权)人：福建医科大学，
类型：发明
国别省市：