一种提高碱性蛋白酶热稳定性的方法及突变体ThAPT3-M6、M7、M8、M9和应用技术

发明专利技术涉及基因工程和蛋白质工程领域，具体涉及一种提高碱性蛋白酶热稳定性的方法及突变体ThAPT3

【技术实现步骤摘要】
一种提高碱性蛋白酶热稳定性的方法及突变体ThAPT3
‑
M6、M7、M8、M9和应用


[0001]专利技术涉及基因工程和蛋白质工程领域，具体涉及一种提高碱性蛋白酶热稳定性的方法及突变体ThAPT3
‑
M6、7、8、9和应用。

技术介绍

[0002]丝氨酸蛋白酶是重要的肽键水解酶类，目前已知的蛋白酶中1/3属于丝氨酸蛋白酶家族。枯草杆菌类蛋白酶家族又称为丝氨酸蛋白酶S8家族，为丝氨酸蛋白酶第二大家族。因此具有广泛的切割特异性和优异的有机溶剂稳定性，被广泛的应用于食品、皮革、医疗和饲料等各个工业领域。蛋白酶在酶制剂领域占有较高的市场份额。但是蛋白酶的热稳定性较差，目前工业上应用最广泛的商用蛋白酶Proteinase K在60℃下稳定性的表现也差强人意。因此碱性蛋白酶在高温环境下的稳定性是限制其进一步工业应用的主要瓶颈。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的是提供以Torrubiella hemipterigena来源的碱性蛋白酶PA3为亲本获得的热稳定性和比活力提高的突变体ThAPT3
‑
M6、ThAPT3
‑
M7、ThAPT3
‑
M8、ThAPT3
‑
M9。
[0004]本专利技术的再一目的是提供上述碱性蛋白酶蛋白酶突变体的基因。
[0005]本专利技术的再一目的是提供包含上述碱性蛋白酶突变体的重组载体。
[0006]本专利技术的再一目的是提供包含上述碱性蛋白酶突变体的重组菌株。
[0007]本专利技术的再一目的是提供制备热稳定性提高的碱性蛋白酶的方法。
[0008]本专利技术的再一目的是提供上述蛋白酶突变体的应用。
[0009]本专利技术以Torrubiella hemipterigena来源的碱性蛋白酶PA3为亲本进行突变，得到热稳定性提高的碱性蛋白酶突变体，其中，PA3的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。(下划线标注为前导肽对应氨基酸序列)
[0010]SEQ ID NO:1：
[0011]APSLARREEPAPLLEARGAQAIPGKFIVKLREGSPLAALQQAMSLLGGKADHVFQNVFSGFAASMNPAVIELMRNHPDVEYIEQDGKVNINAYTTQTGAPWGLGRISHRAKGSTSYTYDTSAGEGTCVYVIDTGVEDTHPEFEGRAKLIKTYYGNRDGHGHGTHCSGTIGSKTYGVAKKTKIYGVKVLDDNGSGTFSNIIAGVDFVANDYKTRGCPKGAVASMSLGGGKTQAVNDAVARLQRAGVFVAVAAGNDNTDAANTSPASEPSVCTVGASDKDDVRSTFSNYGSVVDIFAPGTAILSTWIGGRTNTISGTSMATPHIAGLAAYLMGKDGAVAAGLCAKIAQTATRNVLRNIPAGTINALAFNGNPSG*。
[0012]根据本申请的热稳定性提高的碱性蛋白酶突变体ThAPT3
‑
M6，其中，所述突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示，所示氨基酸序列的突变位点为：loop
18
区域区段替换和定点突变的突变体M2(由M
330
GKDGAVAAGLC
340
替换为M
330
TLGRTTAANAC
340
后，将第333位氨基酸由G突变为N)和α8‑
helix区域的双点组合突变体M4(第342位Ala突变为Glu、第345位Ala突变为Gln)进行叠加。(下划线标注为前导肽对应氨基酸序列，加粗斜体标注为突
变氨基酸)
[0013]SEQ ID NO:2(含前导肽序列)：
[0014][0015]SEQ ID NO:3(不含前导肽序列)：
[0016][0017]根据本申请的热稳定性提高的碱性蛋白酶突变体ThAPT3
‑
M7，其中，所述突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示，所示氨基酸序列的突变位点为：loop
18
区域区段替换和定点突变的突变体M2(由M
330
GKDGAVAAGLC
340
替换为M
330
TLGRTTAANAC
340
后，将第333位氨基酸由G突变为N)和loop
19
区域三点组合突变体M5(第350位Arg突变为Leu、第358位Ala突变为Glu和第371位Ser突变为Asn)进行叠加。(下划线标注为前导肽对应氨基酸序列，加粗斜体标注为突变氨基酸)
[0018]SEQ ID NO:4(含前导肽序列)：
[0019][0020]SEQ ID NO:5(不含前导肽序列)：
[0021][0022]根据本申请的热稳定性提高的碱性蛋白酶突变体ThAPT3
‑
M8，其中，所述突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:7所示，所示氨基酸序列的突变位点为：α8‑
helix区域的双点组合突变体M4(第342位Ala突变为Glu、第345位Ala突变为Gln)和loop
19
区域三点组合突变体M5(第350位Arg突变为Leu、第358位Ala突变为Glu和第371位Ser突变为Asn)进行叠加。(下划线标注为前导肽对应氨基酸序列，加粗斜体标注为突变氨基酸)
[0023]SEQ ID NO:6(含前导肽序列)：
[0024][0025]SEQ ID NO:7(不含前导肽序列)：
[0026][0027][0028]根据本申请的热稳定性提高的碱性蛋白酶突变体ThAPT3
‑
M9，其中，所述突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9所示，所示氨基酸序列的突变位点为：loop
18
区域区段替换和定点突变的突变体M2(由M
330
GKDGAVAAGLC
340
替换为M
330
TLGRTTAANAC
340
后，将第333位氨基酸由G突变为N)、α8‑
helix区域的双点组合突变体M4(第342位Ala突变为Glu、第345位Ala突变为Gln)和loop
19
区域三点组合突变体M5(第350位Arg突变为Leu、第358位Ala突变为Glu和第371位Ser突变为Asn)进行叠加。
[0029]SEQ ID NO：8(含前导肽序列)：
[0030][0031]SEQ ID NO：9(不含前导肽序列)：
[0032][0033]根据本专利技术的具体实施方式，碱性蛋白酶PA3的基因序列如SEQ ID NO:10所示。
[0034]SEQ ID 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高碱性蛋白酶热稳定性和比活的方法，其特征在于，所述方法包括将氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的碱性蛋白酶亲本PA3进行以下突变的步骤：由M
330
GKDGAVAAGLC
340
替换为M
330
TLGRTTAANAC
340
后，将第333位氨基酸由G突变为N，且第342位Ala突变为Glu、第345位Ala突变为Gln；或者由M
330
GKDGAVAAGLC
340
替换为M
330
TLGRTTAANAC
340
后，将第333位氨基酸由G突变为N，且第350位Arg突变为Leu、第358位Ala突变为Glu和第371位Ser突变为Asn；或者第342位Ala突变为Glu、第345位Ala突变为Gln，第350位Arg突变为Leu、第358位Ala突变为Glu、第371位Ser突变为Asn；由M
330
GKDGAVAAGLC
340
替换为M
330
TLGRTTAANAC
340
后，将第333位氨基酸由G突变为N...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦星，王宵，罗会颖，姚斌，王亚茹，黄火清，柏映国，苏小运，王苑，涂涛，张杰，王晓璐，张红莲，于会民，
申请(专利权)人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：