一种防治黄瓜花叶病毒的疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术属于植物病害防治技术领域，具体涉及一种防治黄瓜花叶病毒（CMV）的疫苗，包括pTRV1和四种重组表达载体pTRV2

【技术实现步骤摘要】
一种防治黄瓜花叶病毒的疫苗及其制备方法


[0001]本专利技术属于植物病害防治
，具体涉及一种防治黄瓜花叶病毒的疫苗及其制备方法。

技术介绍

[0002]由植物病毒引起的病害素有“植物癌症”之称，其造成的经济损失非常严重。黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus, CMV）是一种非常严重的病毒病害，病毒可以到达除生长点以外的任何部位。黄瓜花叶病毒是寄主范围最多、分布最广、最具经济重要性的植物病毒之一。黄瓜花叶病毒是三分体正义单链RNA病毒，RNA1含有1个ORF，编码1a复制酶蛋白；RNA2含有2个ORF，5'端编码2a复制酶蛋白，3'端编码2b蛋白。前人研究发现植物受黄瓜花叶病毒侵染后的症状表现是由1a和2a复制酶蛋白共同决定的，二者具有协同作用；RNA3也有2个ORF，5'端编码31kDa的胞间运动蛋白（MP），3'端编码一个24
‑
26kDa的外壳蛋白（CP）。
[0003]目前，在生产上防治黄瓜花叶病毒病通常以化学防治为主，但易造成药剂残留和环境污染等问题。培育抗病品种也是防治黄瓜花叶病的有效方式之一，但育种工作进展缓慢，而生物防治技术已经逐渐成为病害防治的新方法。
[0004]病毒诱导基因沉默（virus
‑
induced gene silence，VIGS）是一种对植物进行反向遗传操作的技术，是植物防御机制的表现。农杆菌介导的VIGS技术通过农杆菌将携带目的基因片段的病毒载体转移到植物细胞中，介导靶向同源基因的mRNA降解，引起目的基因沉默。

技术实现思路

[0005]为解决上述问题，本专利技术构建靶向相关基因片段的烟草脆裂病毒TRV载体并转化农杆菌感受态细胞，为随后的TRV介导的防治黄瓜花叶病毒的VIGS体系的建立奠定基础。
[0006]为解决以上技术问题，本专利技术通过以下技术方案实现：一种防治黄瓜花叶病毒的疫苗，包括pTRV1和至少一种重组表达载体pTRV2
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目标基因，所述目标基因为CMV
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1a、CMV
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2a、CMV
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MP或CMV
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CP，序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
[0007]优选的，所述疫苗包括pTRV1和四种重组表达载体pTRV2
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目标基因，所述目标基因分别为CMV
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1a、CMV
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2a、CMV
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MP和CMV
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CP，序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、 SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
[0008]其中，所述重组表达载体pTRV2
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目标基因由以下步骤构建：（1）提取感染了黄瓜花叶病毒的烟株叶片的总RNA，将其反转成cDNA；（2）再以所述cDNA为模板进行PCR 扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的片段；（3）对pTRV2空载体质粒进行EcoRI/BamHI双酶切，回收酶切产物之后，获得线性化载体；
ID NO.1
‑
4。片段选取完成后，使用Oligo 7软件设计特异性引物，其序列见表1。
[0016]表1 本专利技术设计的引物序列。
[0017]2、VIGS载体的构建利用TRIzol法分别提取感染了黄瓜花叶病毒的烟株叶片的总RNA，具体操作方法依据天根生化科技（北京）有限公司的TRIzol产品的说明书。参照北京全式金生物技术有限公司TransScript One
‑
Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix说明书反转成cDNA。以获得的cDNA为模板，按照表1中相应的引物利用诺唯赞生物技术有限公司的P505高保真酶分别进行PCR 扩增，扩增体系：2
×
Phanta Max Buffer 25μL，dNTP Mix(10 mmol/L) 1μL，Phanta Max Super
‑
Fidelity DNA Polymerase 1μL，10μmol/L的上下游引物各2μL，20μmol/L的cDNA模版1μL，加ddH2O补至50μL。反应条件为预变性95℃ 3min；95℃变性15s，68℃退火15s，72℃延伸30s，35个循环；72℃ 5min。琼脂糖凝胶电泳检测，使用北京全式金生物技术有限公司的凝胶纯化试剂盒回收目的片段，见图2。对pTRV2空载体质粒进行EcoRI/BamHI双酶切，分别回收酶切产物之后，获得线性化载体。利用诺唯赞生物技术有限公司的ClonExpress
®Ⅱ重组克隆试剂盒分别将扩增产物与线性化载体进行连接，随后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞。将测序正确的单克隆菌株扩繁并提取质粒保存，得到重组表达载体pTRV2
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CMV
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1a、pTRV2
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CMV
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2a、pTRV2
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CMV
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MP和pTRV2
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CMV
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CP。
[0018]3、重组表达载体转化参照上海唯地生物技术有限公司的农杆菌GV3101感受态细胞的使用说明书，将重组表达载体pTRV2
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CMV
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1a、pTRV2
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CMV
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2a、pTRV2
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CMV
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MP和pTRV2
‑
CMV
‑
CP分别转化农杆菌GV3101感受态细胞，得到原始菌液。将所得原始菌液均匀涂抹在LB（含有浓度为25mg/mL利福平和50mg/mL卡那霉素）固体培养基上，28℃下倒置培养48h；挑取单菌落经PCR扩增后，使用琼脂糖凝胶电泳检测验证。将验证正确的菌液分别扩繁后保存至
‑
80℃超低温冰箱备用。
[0019]4、产品制备将TRV1菌液和原始菌液TRV2
‑
CMV
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1a、TRV2
‑
CMV
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2a、TRV2
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CMV
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MP、TRV2
‑
CMV
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CP分别接种到LB液体培养基上，28℃、200r/min过夜培养后，调整浓度为OD
600
≈0.8～1.0，再用培养过的TRV1菌液分别与培养过的TRV2
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CMV
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1a、TRV2
‑
CMV
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2a、TRV2
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CMV
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MP、TRV2
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CMV
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CP菌液混合摇匀（等比例混合），之后再等比例将四种混合摇匀液混本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1. 一种防治黄瓜花叶病毒的疫苗，其特征在于：包括pTRV1和至少一种重组表达载体pTRV2
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目标基因，所述目标基因为CMV
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1a、CMV
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2a、CMV
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MP或CMV
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CP，序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。2. 根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于：所述疫苗包括pTRV1和四种重组表达载体pTRV2
‑
目标基因，所述目标基因分别为CMV
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1a、CMV
‑
2a、CMV
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MP和CMV
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CP，序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。3.根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于：所述重组表达载体pTRV2
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目标基因由以下步骤构建：（1）提取感染了黄瓜花叶病毒的烟株叶片的总RNA，将其反转成cDNA；（2）再以所述cDNA为模板进行PCR 扩增，然后进行琼脂糖凝胶电泳检测，回收目的片段；（3）对pTRV2空载体质粒进行EcoRI/BamHI双酶切，回收酶切产物之后，获得线性化载体；（4）将步骤（2）所得扩增产物目的片段与步骤（3）所得线性化载体进行连接，随后转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，扩繁并提取质粒。4. 根据权利要求1所述的疫苗，其特征在于：关于步骤（2）PCR 扩增中对应的引物：当目标基因为CMV
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1a时，引物对为SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6；当目标基因为CMV
‑
2a时，引物对为SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8；当目标基因为CMV
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MP时，引物对为SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10；当目标基因为CMV

【专利技术属性】
技术研发人员：杨铁钊，周方，周健飞，何冰，武兆云，徐世晓，孙聚涛，李俊营，郭玉鸽，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：