用于产生腺相关病毒的试剂盒及其利用制造技术

本发明专利技术的课题在于提供一种用于制作可控制制造腺相关病毒的腺相关病毒产生细胞的试剂盒及整合载体，并且提供一种可控制制造腺相关病毒的腺相关病毒产生细胞、其制造方法及腺相关病毒的制造方法。根据本发明专利技术，提供一种试剂盒，其包含：第一载体，包含1个以上的病毒辅助基因，并且所述病毒辅助基因中的至少一个在可表达调控的启动子的控制下；及第二载体，包含1个以上的腺相关病毒基因，并且所述腺相关病毒基因中的至少一个不在基于药剂的表达调控启动子的控制下。控启动子的控制下。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于产生腺相关病毒的试剂盒及其利用


[0001]本专利技术涉及一种用于制作腺相关病毒产生细胞的试剂盒及整合载体。而且本专利技术涉及一种腺相关病毒产生细胞、其制造方法及腺相关病毒的制造方法。

技术介绍

[0002]腺相关病毒(adeno
‑
associated virus：也称为AAV)是属于细小病毒科的直链单链DNA病毒。野生型AAV基因组包含复制的调控基因(rep基因)和衣壳的结构基因(cap基因)，且为了病毒的复制和包装邻接反向末端重复序列(ITR)。AAV载体能够在增殖或非增殖的任一细胞中进行基因导入，尤其能够在非分裂细胞中进行长期的表达。并且，AAV被认为是非病原性的，且免疫原性较低。根据上述情况，AAV载体作为基因治疗用载体而进行临床应用。
[0003]AAV是在腺病毒和疱疹病毒等辅助病毒的存在下增殖的非包膜病毒。在制作用于基因治疗或核酸导入的AAV时，经典地使腺病毒与宿主细胞共感染而进行了AAV复制。并且，明确了负责腺病毒的辅助作用的基因，还使用搭载了该基因的质粒。例如，通过将包含rep基因及cap基因的质粒、腺病毒辅助质粒及包含导入基因的质粒同时转染到HEK293细胞中，从而能够包装成重组型AAV(rAAV)。
[0004]在专利文献1中，记载有为了产生AAV而使用哺乳动物细胞，所述哺乳动物细胞包含编码在第1可抑制解除的启动子的控制下的病毒辅助基因的核酸分子、编码在第2可抑制解除的启动子的控制下的AAV基因的核酸分子及编码第1及第2可抑制解除的启动子的阻遏要件的核酸分子。
[0005]在专利文献2中，记载有核酸分子，所述核酸分子包含(a)编码AAV的REP蛋白质的碱基序列、(b)编码AAV的衣壳的结构蛋白质的碱基序列、(c)包含第一AAV的反向末端重复(ITR)的碱基序列、(d)包含第二AAV的反向末端重复(ITR)的碱基序列、(e)位于第一ITR与第二ITR之间的、用于插入编码外来的蛋白质的碱基序列的碱基序列或/及编码外来的蛋白质的碱基序列，(f)包含腺病毒的E2A区域的碱基序列、(g)包含腺病毒的E4区域的碱基序列及(h)包含腺病毒的VA1 RNA区域的碱基序列。
[0006]在专利文献3中，记载有一种腺相关病毒(AAV)产生细胞，所述AAV产生细胞包含编码AAV rep/cap基因、辅助病毒基因及AAV载体粒子的DNA基因组的核酸序列，上述核酸序列全部一起整合到AAV产生细胞的基因组内的单一的基因座。
[0007]现有技术文献
[0008]专利文献
[0009]专利文献1：国际公开2020
‑
132059号公报
[0010]专利文献2：日本特开2020
‑
188763号公报
[0011]专利文献3：日本特表2020
‑
517238号公报

技术实现思路

[0012]专利技术要解决的技术课题
[0013]在专利文献1中记载的AAV产生细胞中，认为通过对基因的人工序列附加来避免建立AAV产生细胞株时引起的细胞毒性。但是，在专利文献1中记载的AAV产生细胞中，由于在病毒辅助基因及AAV基因分别附加有人工控制序列，因此有可能产生控制序列之间的串扰(由于控制序列之间的相互干涉而难以控制每个对象基因的表达量)，有可能无法充分地控制AAV产生。在专利文献2及3中记载的AAV产生细胞中，关于通过可表达调控的启动子来控制病毒辅助基因的表达没有具体的记载。
[0014]本专利技术的课题在于提供一种用于制作可控制制造腺相关病毒的腺相关病毒产生细胞的试剂盒及整合载体。本专利技术的另一课题在于提供一种可控制制造腺相关病毒的腺相关病毒产生细胞、其制造方法、及腺相关病毒的制造方法。
[0015]用于解决技术课题的手段
[0016]本专利技术人等为了解决上述课题而进行了深入研究的结果发现，通过使用包含在可表达调控的启动子的控制下的至少一个病毒辅助基因的第一载体和包含不在基于药剂的表达调控启动子的控制下的至少一个腺相关病毒基因的第二载体，能够制造可控制制造腺相关病毒的AAV产生细胞。本专利技术是根据上述见解而完成的。
[0017]根据本专利技术，提供以下专利技术。
[0018]<1>一种试剂盒，其包含：
[0019]第一载体，包含1个以上的病毒辅助基因，并且上述病毒辅助基因中的至少一个在可表达调控的启动子的控制下；及
[0020]第二载体，包含1个以上的腺相关病毒基因，并且上述腺相关病毒基因中的至少一个不在基于药剂的表达调控启动子的控制下。
[0021]<2>根据<1>所述的试剂盒，其中，
[0022]第一载体中的可表达调控的启动子为通过药剂可表达调控的启动子。
[0023]<3>根据<1>或<2>所述的试剂盒，其中，
[0024]第一载体中包含的病毒辅助基因来源于腺病毒。
[0025]<4>根据<1>或<2>所述的试剂盒，其中，
[0026]第一载体中的包含的病毒辅助基因中，E4基因及VA
‑
RNA基因在可表达调控的启动子的控制下。
[0027]<5>根据<1>至<4>中任一项所述的试剂盒，其中，
[0028]第一载体中包含的所有病毒辅助基因在可表达调控的启动子的控制下。
[0029]<6>根据<1>至<5>中任一项所述的试剂盒，其中，
[0030]第一载体中包含的病毒辅助基因为E2基因、E4基因及VA
‑
RNA基因。
[0031]<7>根据<6>所述的试剂盒，其中，
[0032]E4基因为E4ORF6基因。
[0033]<8>根据<6>或<7>所述的试剂盒，其中，
[0034]VA
‑
RNA基因为VA
‑
RNAI基因。
[0035]<9>根据<1>至<8>中任一项所述的试剂盒，其中，
[0036]在第二载体中，所有腺相关病毒基因不在基于药剂的表达调控启动子的控制下。
[0037]<10>根据<1>至<9>中任一项所述的试剂盒，其中，
[0038]在第本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种试剂盒，其包含：第一载体，包含1个以上的病毒辅助基因，并且所述病毒辅助基因中的至少一个在可表达调控的启动子的控制下；及第二载体，包含1个以上的腺相关病毒基因，并且所述腺相关病毒基因中的至少一个不在基于药剂的表达调控启动子的控制下。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其中，第一载体中的可表达调控的启动子为通过药剂可表达调控的启动子。3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其中，第一载体中包含的病毒辅助基因来源于腺病毒。4.根据权利要求1至3中任一项所述的试剂盒，其中，第一载体中包含的病毒辅助基因中，E4基因及VA
‑
RNA基因在可表达调控的启动子的控制下。5.根据权利要求1至4中任一项所述的试剂盒，其中，第一载体中包含的所有病毒辅助基因在可表达调控的启动子的控制下。6.根据权利要求1至5中任一项所述的试剂盒，其中，第一载体中包含的病毒辅助基因为E2基因、E4基因及VA
‑
RNA基因。7.根据权利要求6所述的试剂盒，其中，E4基因为E4ORF6基因。8.根据权利要求6或7所述的试剂盒，其中，VA
‑
RNA基因为VA
‑
RNAI基因。9.根据权利要求1至8中任一项所述的试剂盒，其中，在第二载体中，所有腺相关病毒基因不在基于药剂的表达调控启动子的控制下。10.根据权利要求1至9中任一项所述的试剂盒，其中，在第二载体中，不在基于药剂的表达调控启动子的控制下的腺相关病毒基因中的任一个在腺相关病毒基因天然保持的启动子的控制下。11.根据权利要求1至10中任一项所述的试剂盒，其中，第二载体中包含的腺相关病毒基因为rep基因及cap基因。12.根据权利要求1至11中任一项所述的试剂盒，其中，第二载体中包含的腺相关病毒基因中，不在基于药剂的表达调控启动子的控制下的腺相关病毒基因为rep基因。13.一种细胞，其具有权利要求1至12中任一项所述的试剂盒中包含的第一载体及第二载体。14.根据权利要求13所述的细胞，其中，细胞为人体细胞。15.根据权利要求13或14所述的细胞，其中，在染色体中具有所述第一载体和所述第二载体。16.一种整合载体，其以连结的状态具有：第一载体，包含1个以上的病毒辅助基因，并且所述病毒辅助基因中的至少一个在可表达调控的启动子的控制下；及
第二载体，包含1个以上的腺相关病毒基因，并且所述腺相关病毒基因中的至少一个不在基于药剂的表达调控启动子的控制下。17.根据权利要求16所述的整合载体，其还具有：第三载体，包含所期望的治疗或预防基因。18.一种细胞，其具有权利要求16或17所述的整合载体。19.根据权利要求18所述的细胞，其中，细胞为人体细胞。20.根据权利要求18或19所述的细胞，其中，在染色体中具有所述整合载体。21.一种用于产生腺相关病毒的细胞的制造方法，所述方法包括如下：将第一载体和第二载体导入细胞中，所述第一载体包含1个以上的病毒辅助基因，并且所述病毒辅助基因中的至少一个在可表达调控的启动子的控制下，所述第二载体包含1个以上的腺相关病毒基因，并且所述腺相关病毒基因中的至少一个不在基于药剂的表达调控启动子的控制下。22.一种腺相关病毒的制造方法，其包括：培养包含第一载体、第二载...

【专利技术属性】
技术研发人员：森勇介，村口太一，梅谷彩也子，渡边裕也，
申请(专利权)人：富士胶片株式会社，
类型：发明
国别省市：