α-淀粉酶变体制造技术

本发明专利技术涉及α

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】α
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淀粉酶变体
[0001]序列表的引用
[0002]本申请含有计算机可读形式的序列表，将其通过引用并入本文。


[0003]本专利技术涉及α
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淀粉酶的变体、编码这些变体的多核苷酸和产生这些变体的方法。

技术介绍

[0004]α
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淀粉酶(α
‑
1,4
‑
葡聚糖
‑4‑
葡聚糖水解酶，E.C.3.2.1.1)构成催化淀粉以及其他直链和支链1,4
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糖苷寡糖和多糖的水解的一组酶。
[0005]α
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淀粉酶在例如洗涤剂、烘焙、酿造、淀粉液化和糖化，如在制备高果糖糖浆或作为从淀粉产生乙醇的一部分中，具有悠久的产业应用历史。许多这些和其他的α
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淀粉酶应用使用来源于微生物的α
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淀粉酶，特别是细菌α
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淀粉酶。
[0006]属于首先被使用的细菌α
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淀粉酶是来自地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)的α
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淀粉酶，还称作Termamyl，该Termamyl已经被充分表征并且这种酶的晶体结构已经被确定。碱性淀粉酶，如源自如披露于WO 95/26397中的芽孢杆菌属物种的α
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淀粉酶，形成了用于洗涤剂的特定的α
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淀粉酶组。这些已知的细菌淀粉酶中许多已经经修饰以改善它们在特定应用中的功能性。
[0007]因此，本专利技术的一个目的是提供具有α
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淀粉酶活性的α
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淀粉酶变体，与亲本α
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淀粉酶相比，该变体具有改善的特性(如比活性)。
[0008]本专利技术提供了具有α
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淀粉酶活性并且与其亲本α
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淀粉酶相比具有改善的特性的α
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淀粉酶变体。

技术实现思路

[0009]本专利技术涉及亲本α
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淀粉酶的α
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淀粉酶变体，该α
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淀粉酶变体包含a)在对应于位置181、182、183和184的两个或三个或四个位置处的缺失和/或取代，以及b)在对应于以下位置的一个或多个(例如，几个)位置处的改变：54、109、172、174、195、206、391、473和476，使用SEQ ID NO:1进行编号，并且其中每个改变独立地是取代、插入或缺失，并且其中所述变体与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％但小于100％的序列同一性，并且其中所述变体具有α
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淀粉酶活性，并且其中所述变体与所述亲本α
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淀粉酶相比具有改进的洗涤性能。
[0010]本专利技术还涉及产生α
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淀粉酶变体的方法，该方法包括：(a)在适合于该变体表达的条件下培养本专利技术的宿主细胞；和(b)回收该变体。
[0011]本专利技术进一步涉及获得亲本α
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淀粉酶的α
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淀粉酶变体的方法，该方法包括a)引入
a)在对应于位置181、182、183和184的两个或三个或四个位置处的缺失和/或取代，以及b)在对应于以下位置的一个或多个(例如，几个)位置处的改变：54、109、172、174、195、206、391、473和476，使用SEQ ID NO:1进行编号；所述方法由此提供所述亲本α
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淀粉酶的α
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淀粉酶变体，其中所述变体与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的多肽的氨基酸序列具有至少60％、例如至少65％、例如至少70％、例如至少75％、例如至少80％、例如至少85％、例如至少90％、例如至少95％、例如至少97％、例如至少99％但小于100％的序列同一性，并且其中所述变体具有α
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淀粉酶活性，并且其中该α
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淀粉酶变体相对于所述亲本具有改善的特性。
[0012]定义
[0013]根据此详细描述，以下定义适用。注意，单数形式“一种/个(a/an)”以及“该/这些(the)”包括复数个指示物，除非上下文中另外明确指明。
[0014]本文提及“约”值或参数包括针对该值或参数本身的方面。例如，提及“约X”的描述包括方面“X”。
[0015]除非另外定义或由上下文明确指示，否则本文所用的全部技术与科学术语具有如本专利技术所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
[0016]A、B和C结构域：α
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淀粉酶的结构包含三个不同结构域A、B和C，参见例如Machius等人,1995,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志]246:545
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559。术语“结构域”意指在其自身形成完整分子的不同且独立的子结构的多肽区域。α
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淀粉酶由携带活性位点残基的β/α
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8桶状结构(其表示为A结构域)、β
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折叠3和α
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螺旋3之间相当长的环状结构(其表示为B结构域)(一起；“A和B结构域”)和C结构域，并且在某些情况下还由碳水化合物结合结构域组成(例如，WO 2005/001064；Machius等人,同上)。
[0017]α
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淀粉酶的结构域可以通过结构分析来确定，如使用结晶学技术。用于确定α
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淀粉酶的结构域的可替代方法是通过该α
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淀粉酶与另一个已经确定结构域的α
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淀粉酶的氨基酸序列的序列比对。与例如已经确定了C结构域的α
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淀粉酶中的C结构域序列对齐的序列可以视为给定α
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淀粉酶的C结构域。
[0018]A和B结构域：如本文使用的术语“A和B结构域”意指这些视为一个单元的两个结构域，然而该C结构域是这些α
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淀粉酶的另一个单元。因而，“A和B结构域”的氨基酸序列被理解为包括“A和B结构域”和其他结构域(如C结构域)的α
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淀粉酶的序列的一个序列或序列的一部分。如本文所用，α
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淀粉酶的“A和B结构域”对应于SEQ ID NO:1的氨基酸1
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399。
[0019]等位基因变体：术语“等位基因变体”意指占据同一染色体基因座的基因的两种或更多种替代形式中的任一种。等位基因变异通过突变而自然产生，并且可以导致群体内部的多态性。基因突变可以是本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种亲本α
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淀粉酶的α
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淀粉酶变体，该α
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淀粉酶变体包含a)在对应于位置181、182、183和184的两个或三个或四个位置处的缺失和/或取代，以及b)在对应于以下位置的一个或多个(例如，几个)位置处的改变：54、109、172、174、195、206、391、473和476，使用SEQ ID NO:1进行编号，并且其中每个改变独立地是取代、插入或缺失，并且其中所述变体与SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15的多肽具有至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％但小于100％的序列同一性，并且其中所述变体具有α
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淀粉酶活性，并且其中所述变体与所述亲本α
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淀粉酶相比具有改进的洗涤性能。2.如权利要求1所述的α
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淀粉酶变体，其相对于该亲本α
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淀粉酶具有改善的特性，其中该改善的特性选自由以下组成的组：增加的催化效率、增加的催化速率、增加的化学稳定性、增加的氧化稳定性、增加的pH活性、增加的pH稳定性、增加的比活性、储存条件下增加的稳定性、增加的底物结合、增加的底物切割、增加的底物特异性、增加的底物稳定性、增加的表面特性、增加的热活性和增加的热稳定性。3.如前述权利要求所述的α
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淀粉酶变体，其中a)缺失选自由以下组成的组：R181*+G182*、R181*+D183*、R181*+G184*、G182*+D183*、G182*+G184*、或D183*+G184*，优选G182*+D183*，使用SEQ ID NO:1进行编号。4.如前述权利要求所述的α
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淀粉酶变体，其中b)在对应于以下位置的一个或多个位置处的改变：N54、G109、Q172、A174、N195、V206、K391、P473和G476，使用SEQ ID NO:1进行编号。5.如前述权利要求所述的α
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淀粉酶变体，其中所述变体进一步包含在对应于以下位置的一个或多个(例如，几个)位置处的改变：1、2、3、4、5、9、16、17、20、22、25、28、29、30、31、32、33、35、36、37、40、42、48、56、70、72、75、82、83、84、86、87、89、90、91、93、94、95、98、105、113、116、118、125、129、130、131、132、134、135、136、138、140、142、144、150、151、152、154、158、165、167、169、178、186、190、208、212、214、215、217、218、219、220、222、225、227、229、235、244、246、250、251、255、256、260、261、263、275、280、281、284、285、286、288、295、296、297、299、304、306、311、312、313、317、319、320、323、324、325、337、339、345、346、355、356、361、365、371、376、377、381、382、383、384、385、387、389、394、395、400、405、407、408、410、411、418、419、420、421、422、423、428、429、430、431、437、439、442、444、445、446、449、450、451、452、454、459、460、461、463、465、466、467、469、471、474、481、482、484和485，使用SEQ ID NO:1进行编号。6.如前述权利要求所述的α
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淀粉酶变体，其中所述变体包含a)对应于位置G182*+D183*的氨基酸的成对缺失和b)对应于以下位置的一个或更多个位置处的改变：N54、G109、Q172、A174、N195、V206、K391、P473和G476，并且进一步包含在对应于以下位置的一个或多个(例如，几个)位置处的改变：H1、H2、D3、G4、T5、I9、N16、V17、D20、Q22、N25、H28、N29、N30、A31、Q32、N33、K35、N36、A37、T40、I42、W48、V56、N70、K72、V75、K82、A83、E84、E86、R87、I89、R90、S91、K93、A94、N95、Q98、M105、F113、R116、Q118、Q125、Q129、E130、V131、S132、T134、Y135、Q136、E138、W140、G142、N144、N150、Q151、H152、S154、R158、T165、W167、Q16、Y178、A186、E190、M208、E212、I214、N215、L217、N218、R219、W220、V222、A225、T227、N229、L235、
S244、M246、L250、G251、G255、Q256、N260、L261、A263、L275、S280、K281、W284、T285、M286、A288、Y295、N296、L297、Q299、S304、N306、N311、L312、L313F、L317、Q319、R320、S323、H324、A325、G337、A339、Q345、G346、T355、I356、Q361、Q365、Y371、S376、D377、S381、Y382、R383、Q384、Q385、D387、L389、Q394、Q395、T400、L405、N407、Q408、V410、I411、D418、S419、A420、H421、A422、G423、T428、V429、M430、S431、S437、T439、T439、V442、T444、A445、H446、Q449、V450、F451、K452、I454、T459、D460、T461、T463、N465、S466、A467、N469、T471、C474、I481、W482、K484、Q485、Q485，使用SEQ ID NO:1用于编号。7.如前述权利要求中任一项所述的变体，其中该变体包含以下改变或改变的组合中的至少一个：(xxix)H1*+T5L+V17M+N54S+V56T+K72R+E86Q+G109A+F113Q+R116Q+Q151T+H152Y+W167F+Q172G+A174S+G182*+D183*+G184T+N195F+V206L+E212D+N215A+N218K+V222T+T227E+L250V+G255E+Q256K+L261M+A263T+A288V+N296Q+S304G+N306G+L317V+Q319S+R320K+A325S+G346T+Q361S+Y382L+Q384H+Q385K+L389I+K391A+H421V+P473R+G476K；(xxx)H1*+N25K+H28Q+Q32A+K35A+N36E+N54S+V56T+N70H+R87S+R90K+A94S+N95R+Q98N+G109A+F113A+R116D+Q118T+Q125A+E130V+V131I+T134E+Y135H+Q136L+E138K+G142H+N144H+R158Y+Q169E+Q172K+A174*+R181Q+G182*+D183*+N195F+V206L+T400R+L405F+N407H+Q408W+D418N+S419A+A420S+A422P+G423N+V429I+T439W+T444R+A445Q+H446K+Q449E+F451W+K452H+I454M+T459S+D460G+S466Q+A467D+N469W+T471H+P473F+C474V+I481V+Q485R；(xxxi)H1*+T5L+V17M+N54S+V56T+E86Q+G109A+Q151T+H152Y+Q169E+Q172K+A174*+Y178F+G182*+D183*+N195F+V206L+E212D+N215A+N218K+V222T+T227E+L250V+Q256K+L261M+A263T+A288V+N296Q+S304G+N306G+L317V+Q319S+R320K+A325S+G346T+Y382L+Q384H+Q385K+L389I+K391A+H421V+G476K；(xxxii)H1*+N30E+N33Y+A37H+N54S+V56T+G109A+Q169E+Q172K+A174*+G182*+D183*+N195F+V206L+Y371M+R383K+Q384H+Q385K+D387E+K391A+T400A+N407H+Q408H+V410I+H421V+G423N+T428A+V429L+S437A+T444A+A445Q+V450T+F451W+K452H+T459S+D460E+T461P+T463V+T471E+P473H+C474V+G476K+Q485R；(xxxiii)H1*+T5L+V17M+H28Q+N36E+N54S+V56T+R87S+G109A+R116D+Q129R+E130V+Q136L+E138K+Q151T+H152Y+Q169E+Q172K+A174*+G182*+D183*+N195F+V206L+L250V+L261M+M286H+N306G+Q319S+R320K+A325S+G346T+Y382L+L389I+K391A+Q394K+T400A+H421V+T444A+V450T+T459S+T463V+P473H+G476K；(xxxiv)H1*+T5L+I9M+N33Y+K35A+N36E+A37H+N54A+V56T+R87S+N95R+G109A+F113Q+R116Q+W167F+Q172G+A174S+G182*+D183*+G184T+N195F+V206L+S280N+W284F+N296Q+L297F+N311K+L317V+Q319S+R320K+H324K+T355F+Q361S+Y371M+R383K+Q384H+D387E+K391A+Q394K+T400A+L405F+H421V+G423N+P473R+G476K；(xxxv)H1*+N54S+V56T+M105I+G109A+F113Q+R116D+V131I+Y135H+Q136L+E138K+W167F+Q169E+Q172G+A174*+G182*+D183*+G184T+N195F+V206Y+M208Y+L217I+M246L+L250V+A263T+G346T+S381A+Q384H+Q385K+K391A+V410I+H421V+G423N+S437A+T444A+K452H+D460E+T461P+T463V+P473H+G476K+Q485R；
(xxxvi)H1*+N25R+H28Q+N30D+N54A+V56T+N70H+A83G+E86Q+R87S+R90K+K93H+Q98N+G109A+F113A+R116D+Q118T+E130V+V131I+Q136L+E138K+G142H+N144H+N150S+H152Y+S154D+R158Y+W167F+Q172G+A174S+R181Q+G182*+D183*+G184T+N195F+V206L+T227E+N229Q+T355F+Q361S+Q384H+K391A+P473R+G476K；(xxxvii)H1*+H2*+D3A+G4N+T5L+I9L+N25K+H28Q+Q32A+K35A+N36E+N54S+V56T+N70H+R87S+R90K+A94S+N95R+Q98N+G109A+F113Q+R116Q+Q118T+Q125A+E130V+V131I+T134E+Q136L+E138K+G142H+N144H+R158Y+W167F+Q172G+A174S+R181Q+G182*+D183*+G184T+N195F+V206L+K391A+Q394K+P473R+G476K；(xxxviii)H1*+T5L+V17M+H28Q+N36E+N54S+V56T+K72R+R87S+G109A+F113Q+R116Q+Q129R+E130V+Q136L+E138K+Q151T+H152Y+W167F+Q172G+A174S+G182*+D183*+G184T+N195F+V206L+L250V+L261M+M286H+N306G+Q319S+R320K+A325S+G346T+Y382L+L389I+K391A+Q394K+T400A+H421V+T444A+V450T+T459S+T463V+P473H+C474V+G476K；(xxxix)H1*+I9L+D20Y+A31S+Q32A+K35A+N54S+V56T+N70H+E86Q+R90K+A94S+N95R+Q98N+G109A+F113Q+R116Q+Q125A+V131I+G142H+N144H+R158Y+W167F+Q172G+A174S+G182*+D183*+G184T+N195F+V206L+E212D+W220L+V222T+T227E+A288V+L317V+K391A+V410I+I411V+T428A+V429L+M430I+T444A+T461P+P473R+C474V+G476K；(xl)H1*+I9L+A31S+Q32A+K35A+N54A+V56T+N70H+E86Q+R90K+A94S+N95R+Q98N+G109A+F113A+Q125A+V131I+G142H+N144H+R158Y+Q169E+Q172K+A174*+Y178F+G182*+D183*+N195F+V206L+E212D+V222T+T227E+A288V+L317V+K391A+V410I+I411V+T428A+V429L+M430I+T461P+C474V+G476K；(xli)H1*+I9L+N25R+H28Q+N30D+I42V+N54A+V56T+N70H+A83G+E86Q+R87S+R90K+K93H+Q98N+G109A+F113A+R116D+Q118T+E130V+V131I+Q136L+E138K+G142H+N144H+N150S+H152Y+S154D+R158Y+W167F+Q172G+A174S+R181Q+G182*+D183*+G184T+N195F+V206L+T227E+N229Q+A288V+L317V+T355F+Q361S+Q384H+L389I+K391A+F451W+P473R+G476K；(xlii)H1*+N25R+H28Q+N30D+N54A+V56T+N70H+A83G+E86Q+R87S+R90K+K93H+Q98N+G109A+F113A+R116D+Q118N+E130V+V131I+Q136L+E138K+G142H+N144H+N150S+H152Y+S154D+R158Y+W167F+Q172G+A174S+R181Q+G182*+D183*+G184T+E190P+N195F+V206L+T227E+N229Q+S280N+W284F+T285N+M286H+A288V+L317V+Q319S+R320M+S323L+H324K+A325S+T355F+Q361S+Q365S+Q384H+K391A+P473R+G476K；(xliii)H1*+N25R+H28Q+N30D+N54A+V56T+N70H+A83G+E86Q+R87S+R90K+K93H+Q98N+G109A+F113A+R116D+Q118T+E130V+V131I+Q136L+E138K+G142H+N144H+N150S+H152Y+S154D+R158Y+W167F+Q172G+A174S+R181Q+G182*+D183*+G184T+N195F+V206L+T227E+N229Q+T355F+Q361S+Q384H+K391A+T400A+L405F+N407H+Q408H+V410I+I411V+A420S+H421V+G423N+T428A+V429L+M430I+S431T+S437A+T444R+A445Q+H446N+Q449E+V450T+F451W+K452H+T459S+T463V+P473R+C474V+G476K+W482Y+K484Q+Q485R；(xliv)H1*+N25R+H28Q+N30D+W48Y+N54S+V56T+N70H+A83G+E86Q+R87S+R90K+K93H+Q98N+G109A+F113A+R116D+Q118N+E130V+V131I+Q136L+E138K+G142H+N144H+N150S+H152Y+S154D+R158Y+W167F+Q172G+A174*+R181Q+G182*+D183*+G184T+E190P+N195F+V206L+T227...

【专利技术属性】
技术研发人员：C，
申请(专利权)人：诺维信公司，
类型：发明
国别省市：