一种基于Ca3(PO4)2矿化RNA纳米水凝胶的制备及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种基于Ca3(PO4)2矿化RNA纳米水凝胶的制备及其应用，属于生物医药技术领域。本发明专利技术针对三阴性乳腺癌治疗出现的问题，基于核酸滚环转录技术构建核酸纳米水凝胶体系，结合基因治疗、改善肿瘤微环境、仿生矿化、饥饿治疗等联合治疗手段对三阴性乳腺癌细胞的增殖进行抑制，同时达到共传递增强药物的靶向性，有效降低药物对正常细胞组织所产生的毒副损伤的目的。副损伤的目的。副损伤的目的。

【技术实现步骤摘要】
一种基于Ca3(PO4)2矿化RNA纳米水凝胶的制备及其应用


[0001]本专利技术属于生物医药
，尤其涉及一种基于Ca3(PO4)2矿化RNA纳米水凝胶的制备及其应用。

技术介绍

[0002]当今生活中，肿瘤严重威胁人类健康和人类生命。恶性肿瘤因其独特的生物学行为，对患者机体会产生较多的影响和危害，例如：（1）恶性肿瘤细胞比较活跃，生长迅速，在生长过程中会对周围组织器官造成压迫，产生疼痛感；（2）恶性肿瘤容易对周围的血管产生浸润侵袭，引起肿瘤相关的出血风险；（3）随着恶性肿瘤的不断发展，还会通过血液循环系统等机体正常生理机能转移到其他脏器，形成晚期恶性肿瘤，严重威胁患者生命。科研工作者将具有特定功能的核酸分子称为功能核酸，功能核酸作为了基因治疗的主要研究和设计对象，在人体细胞内具有生物相容性好、排异反应小等优点，但是因裸露的功能性DNA或RNA序列片段，在人体的血液循环中很容易被酶破坏或者降解。因此，开发优良的运输功能核酸的运输载体，成为当今科研工作者的一大研究方向。
[0003]乳腺癌超越肺癌，成为全球最常见的癌症病理类型，其中在女性患者最为常见，然而，虽然乳腺癌发病率较高，其预后却相对较好。但是缺乏表达雌激素受体（ER）、孕激素受体（PR）和人类表皮生长因子受体2（HER2）的三阴性乳腺（TNBCs），是乳腺癌中的特殊一员，却极具侵袭性，且其预后状况极差，晚期患者仅有12.2%的5年生存率。现如今，三阴性乳腺癌患者的治疗手段相对来说比较局限，早期以手术治疗为主，但因其具有较高的复发率，通常还要在术前和术后进行化疗。然而化疗因其药物的毒性和作用机理，对机体的肝、肾、心、肺等器官具有一定的损伤，严重者会引起器官衰竭、危及生命。针对手术治疗和化疗存在的这些弊端，新型治疗手段的研究具有重要意义。当前，光动力、光热及基因等治疗方法成为当今科研工作者的研究热潮，其中各个疗法均有其无法取代的优点。单纯的治疗手段虽然也可以达到一定的治愈作用,但由于癌症病人数量和肿瘤复杂度的逐渐增加，也导致其达不到预想的治愈效果。因此，同时整合多种疗法——联合治疗（协同治疗），不但能够互补不同治疗手段之间优势，而且还可以提高肿瘤治疗的效果，所以具有非常重要的临床价值和科学意义。
[0004]现今，在肿瘤的诊治过程中，水凝胶已成为药物输送的一种重要载体。因为核酸作为生物内源性物质，其在人体细胞内的生物相容性好，排异反应小，所以受到研究者的广泛关注。磷酸钙（CaP）被认为是具有高生物相容性和pH响应性的无机药物/基因载体。RNA干扰（RNAi）是由短干扰RNA（siRNA）或微小RNA（microRNA）触发的内源性调节途径，通过激活RNAi，siRNA可以高效沉默任何基因的表达，特别是，RNAi提供了一种通过抑制与人类疾病相关的特定基因的表达来达到治疗疾病这一目的的工具，如癌症、病毒感染和遗传疾病，因此利用siRNA作为潜在药物的方法已经引起了极大的关注。MicroRNAs在调控基因表达和细胞命运中起着重要作用。RNA纳米花结构由于其本身简单的结构设计，优良的生物相容性以及可以转录出大量的与肿瘤诊疗相关的siRNA和microRNA片段这些优势，已经被广泛应用
于生物医学等领域。单纯的核酸材料在体内循环中很容易被清除和降解，向体内递送RNA的方式有很多种，如脂质体递送、纳米花递送、质粒递送等，甚至有的递送体系还存在光响应触发，即在红外光的照射下释放siRNA和光敏剂，协同基因治疗和光动力治疗，增加对肿瘤的治疗效果。

技术实现思路

[0005]本专利技术以RNA纳米水凝胶为载体，结合基因疗法(Gene therapy)、饥饿治疗(Starvation therapy, ST)以及细胞原位矿化（Cell in situ mineralization）等方法联合治疗恶性肿瘤。
[0006]本专利技术的目的之一在于提供一种基于Ca3(PO4)2矿化RNA纳米水凝胶，所述纳米水凝胶的制备方法包括以下步骤：（1）分别吸取浓度都为8
‑
12 μM的序列如SEQ ID NO.1所示的转录模板单链DNA和序列如SEQ ID NO.2所示的T7启动子各8
‑
12 μL混合，调节使其成为浓度分别为4
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6μM的水溶液，RCA聚合结束后样品进行冷藏并静置，后加入18
‑
22 μL 8
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12 μM的DNA
‑
胆固醇，其中DNA序列如SEQ ID NO.3所示，缓慢冷却并冷藏静置，后洗涤上述产物；（2）RNF
‑
Chol@CAP的合成将步骤（1）中获得的产物分散到20 mM pH=9.0 Tris
‑
HCl buffer中，使其浓度为0.2
‑
0.3 μM；将所得到的溶液与15 mM NaH2PO4溶液按4
‑
6:2
‑
4体积比混合均匀，冷藏放置一段时间，再加入与NaH2PO4溶液等体积的4
‑
6 mM的CaCl2溶液，并冷藏静置；（3）RNF
‑
Chol@CAPX的合成步骤（2）中所得溶液40
‑
44 μL离心去除上清液后，分散到135
‑
145 μL 18
‑
22 μM序列如SEQ ID NO.4所示的LXL
‑
aptamer水溶液中, 冷藏放置即得到最终样品。
[0007]优选地，所述步骤（1）中RCA的聚合过程如下：95 ℃加热5 min，然后以0.3 ℃ / min 的梯度缓慢冷却至25 ℃，随后加入3 μL H2O，3 μL 10
×
T4 Ligase buffer和4 μL T4 Ligase，充分震荡均匀后16 ℃反应12 h，隔夜后在65 ℃下加热10 min，随后缓慢冷却至25 ℃，将T4 Ligase灭活后，在反应体系中加5 μL 10
×
T7 Polymerase buffer，5 μL rNTPs，7 μL H2O和3 μL T7 Polymerase，充分震荡混合均匀后，37 ℃ 孵育8 h。
[0008]更优选地，所述步骤（1）中SEQ ID NO.1所示的转录模板单链DNA和序列如SEQ ID NO.2所示的T7启动子的浓度都为10μM，体积都为10μL，所述DNA
‑
胆固醇的体积为20μL，浓度为10 μM。
[0009]更优选地，所述步骤（2）中步骤（1）中的产物分散到20 mM pH=9.0 Tris
‑
HCl buffer中，使其浓度为20 μM，将所得到的溶液与15 mM NaH2PO4溶液按5:3体积比混合均匀，CaCl2溶液的浓度为4
‑
6 mM。
[0010]更优选地，所述步骤（3）中步骤（2）中所得溶液154 μL离心去除上清液后，分散到140 μL 20 μM序列如SEQ ID NO.4所示本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于Ca3(PO4)2矿化RNA纳米水凝胶，其特征在于，所述纳米水凝胶的制备方法包括以下步骤：（1）分别吸取浓度都为8
‑
12 μM的序列如SEQ ID NO.1所示的转录模板单链DNA和序列如SEQ ID NO.2所示的T7启动子各8
‑
12 μL混合，调节使其成为浓度分别为4
‑
6μM的水溶液，RCA聚合结束后样品进行冷藏并静置，后加入18
‑
22 μL 8
‑
12 μM的DNA
‑
胆固醇，其中DNA序列如SEQ ID NO.3所示，缓慢冷却并冷藏静置，后洗涤上述产物；（2）RNF
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Chol@CAP的合成将步骤（1）中获得的产物分散到20 mM pH=9.0 Tris
‑
HCl buffer中，调节使其浓度为0.2
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0.3 μM；将所得到的溶液与15 mM NaH2PO4溶液按4
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6:2
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4体积比混合均匀，冷藏放置一段时间，再加入与NaH2PO4溶液等体积的4
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6 mM的CaCl2溶液，并冷藏静置；（3）RNF
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Chol@CAPX的合成步骤（2）中所得溶液140
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160 μL离心去除上清液后，分散到135
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145 μL 18
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22 μM序列如SEQ ID NO.4所示的LXL
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aptamer水溶液中, 冷藏放置即得到最终样品。2.根据权利要求1所述的基于Ca3(PO4)2矿化RNA纳米水凝胶，其特征在于，所述步骤（1）中RCA的聚合过程如下：95 ℃加热5 min，然后以0.3 ℃ / min 的梯度缓慢冷却至25 ℃，随后加入3 μL H2O，3 μL 10
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【专利技术属性】
技术研发人员：李雪梅，马明惠，殷昀，王维才，颜峰，
申请(专利权)人：临沂大学，
类型：发明
国别省市：