从异丁香酚生物合成香草醛制造技术

本公开总体涉及使用异丁香酚作为底物通过生物转化生产天然香草醛。更具体地，本公开方法利用真菌异丁香酚单加氧酶催化异丁香酚到香草醛的生物转化，这可以在细胞系统(例如，细菌或酵母)中或在没有细胞系统的酶促反应混合物中进行。合物中进行。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】从异丁香酚生物合成香草醛
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求于2020年12月18日提交的美国临时专利申请第63/127,487号的权益，其通过引用整体引入本文。
[0003]序列表
[0004]本申请包含序列表，其已按ASCII格式以电子方式提交，并且在此通过引用整体并入本文。所述ASCII副本创建于2021年12月17日，命名为074008_2041_WO_000323_SL.txt，大小为26,382字节。


[0005]本公开总体涉及使用异丁香酚作为底物通过生物转化生产天然香草醛。

技术介绍

[0006]香草香料是世界上最常用的香料之一。它们被用于多种食品如冰淇淋、乳制品、甜点、糖果、烘焙产品和烈酒的调味剂。它们也被用于香水、药品和个人卫生用品。
[0007]传统上，天然香草香料是从香草兰的发酵豆荚中获得的。其主要是在收获后经过数周的干燥和发酵过程经豆类中存在的香草醛葡萄糖苷水解而成。香草香料的主要芳香物质是香草醛(4
‑
羟基3
‑
甲氧基苯甲醛)。
[0008]香草醛是最常见的香料化学品之一，广泛应用于食品饮料、香水、制药和医疗行业。每年消耗约12,000吨香草醛，其中只有20至50吨是从香草豆中提取的；其余是合成生产的，主要来自愈创木酚和木质素等石化产品。近年来，对天然香料的需求不断增加，促使香料行业通过生物转化来生产香草醛，因为这种生物转化的产品在从活细胞或其酶等生物来源生产时被各种监管和立法机构(例如，欧洲共同体立法)视为天然的，并可作为“天然产品”销售。
[0009]天然异丁香酚可以从精油中提取，并且通过酶促转化或微生物生物转化用于生产香草醛是经济的。通过异丁香酚转化生产香草醛已在许多微生物中被广泛报道，包括黑曲霉(Aspergillus niger)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。然而，这些微生物产生的报告的滴度非常低(低于2g/L)，极大地限制了这种方法在行业中的实际应用。此外，报告的生物转化过程复杂，进一步增加了香草醛的生产成本。
[0010]因此，本领域需要更具成本效益的方法来生产具有更高滴度和转化率的香草醛。

技术实现思路

[0011]专利技术人通过鉴定真菌异丁香酚单加氧酶解决了上述问题，该酶与先前报告的已用于生产香草醛的异丁香酚单加氧酶具有非常低的序列同一性。从沼泽紫菌(Violaceomyces paulstris)(VpIEM)鉴定的真菌异丁香酚单加氧酶显示出惊人的高活性，可将异丁香酚转化为香草醛。构建了包含所述VpIEM基因的表达质粒，并开发了工程微生物宿主菌株并用于
以高滴度和转化率从异丁香酚生产香草醛。由所述VpIEM基因表达的重组蛋白也可分离纯化，并用于在体外将异丁香酚转化为香草醛。
[0012]因此，一方面，本公开涉及一种生产香草醛的生物转化方法。该方法可以包括在混合物中表达VpIEM基因，将异丁香酚添加到混合物中，以及将异丁香酚转化为香草醛。在一些实施例中，所表达的VpIEM基因可以具有与SEQ ID NO:2具有至少60％同一性、与SEQ ID NO:2具有至少65％同一性、与SEQ ID NO:2具有至少70％同一性、与SEQ ID NO:2具有至少75％同一性、与SEQ ID NO:2具有至少80％同一性、与SEQ ID NO:2具有至少85％同一性、与SEQ ID NO:2具有至少90％同一性、与SEQ ID NO:2具有至少95％同一性或与SEQ ID NO:2具有至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，所表达的VpIEM基因可以具有与SEQ ID NO:2相同的氨基酸序列。
[0013]在各种实施例中，生物转化方法可以包括通过体外翻译表达VpIEM基因。在备选实施例中，生物转化方法可以包括在细胞系统中表达VpIEM基因。在某些实施例中，生物转化方法可以包括在细菌或酵母细胞中表达VpIEM基因。生物转化方法可以包括纯化来自将VpIEM基因表达为重组蛋白的步骤的产物。在一些实施例中，可以将纯化的重组蛋白作为生物催化剂添加到含有异丁香酚的反应混合物中。在一些实施例中，可以将异丁香酚直接供给到表达VpIEM基因的混合物中。
[0014]本文所述的生物转化方法可以包括从混合物中回收香草醛。香草醛的回收可以根据本领域已知的任何常规分离或纯化方法进行。在回收香草醛之前，该方法还可以包括从混合物中去除生物质(酶、细胞材料等)。
[0015]在一个方面，本公开涉及一种使用分离的重组宿主细胞生产香草醛的方法，其中该分离的重组宿主细胞已经用核酸构建体转变，该核酸构建体包括能够编码异丁香酚单加氧酶的多核苷酸序列。例如，异丁香酚单加氧酶可以具有与SEQ ID NO:2具有至少60％同一性、与SEQ ID NO:2具有至少65％同一性、与SEQ ID NO:2具有至少70％同一性、与SEQ ID NO:2具有至少75％同一性、与SEQ ID NO:2具有至少80％同一性、与SEQ ID NO:2具有至少85％同一性、与SEQ ID NO:2具有至少90％同一性、与SEQ ID NO:2具有至少95％同一性或与SEQ ID NO:2具有至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，异丁香酚单加氧酶可以具有与SEQ ID NO:2相同的氨基酸序列。在一些实施例中，该方法可以包括(i)在培养基中培养分离的重组宿主细胞；(ii)向培养基中加入异丁香酚以开始异丁香酚到香草醛的生物转化；以及(iii)从培养基中提取香草醛。在其他实施例中，该方法可以包括(i)在培养基中培养分离的重组宿主细胞以允许异丁香酚单加氧酶表达；(ii)分离异丁香酚单加氧酶；(iii)将分离的异丁香酚单加氧酶添加到包含异丁香酚的反应混合物中；以及(iv)从反应介质中提取香草醛。
[0016]在一个方面，本公开涉及一种用包含编码异丁香酚单加氧酶的多核苷酸序列的核酸构建体转变的分离的重组宿主细胞，其中该异丁香酚单加氧酶具有与SEQ ID NO:2具有至少60％同一性、与SEQ ID NO:2具有至少65％同一性、与SEQ ID NO:2具有至少70％同一性、与SEQ ID NO:2具有至少75％同一性、与SEQ ID NO:2具有至少80％同一性、与SEQ ID NO:2具有至少85％同一性、与SEQ ID NO:2具有至少90％同一性、与SEQ ID NO:2具有至少95％同一性或与SEQ ID NO:2具有至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施例中，异丁香酚单加氧酶可以具有与SEQ ID NO:2相同的氨基酸序列。在一些实施例中，核酸构建体可以
含有多核苷酸序列，该多核苷酸序列包括与SEQ ID NO:1的核酸序列至少70％同一、与SEQ ID NO:1的核酸序列至少75％同一、与SEQ ID NO:1的核酸序列80％同一、与SEQ ID NO:1的核酸序列85％同一、与SEQ ID NO:1的核本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种生产香草醛的生物转化方法，其包括：a.在混合物中表达VpIEM基因，其中所述VpIEM基因的所表达的蛋白具有与所述混合物中的SEQ ID NO:2具有至少70％同一性的氨基酸序列；b.向所述混合物中供给异丁香酚；以及c.将所述异丁香酚转化为所述香草醛。2.根据权利要求1所述的方法，其中所表达的VpIEM蛋白具有与SEQ ID NO:2具有至少80％同一性的氨基酸序列，其中所述蛋白将所述异丁香酚转化为所述香草醛。3.根据权利要求1所述的方法，其中所表达的VpIEM蛋白具有与SEQ ID NO:2具有至少90％同一性的氨基酸序列。4.根据权利要求1所述的方法，其中所表达的VpIEM蛋白具有与SEQ ID NO:2具有至少95％同一性的氨基酸序列。5.根据权利要求1所述的方法，其中表达所述VpIEM基因的步骤选自由以下组成的群组：通过体外翻译表达所述基因；在细胞系统中表达所述基因；以及在细菌或酵母细胞中表达所述基因。6.根据权利要求5所述的方法，其还包括：纯化来自将所述VpIEM基因表达为重组蛋白的步骤的所述产物。7.根据权利要求1所述的方法，其还包括：收集所述香草醛。8.根据权利要求7所述的方法，其中所述异丁香酚到所述香草醛的转化率高于80％。9.根据权利要求7所述的方法，其中所述异丁香酚到所述香草醛的转化率高于85％。10.根据权利要求7所述的方法，其中所述异丁香酚到所述香草醛的转化率高于90％。11.一种使用分离的重组宿主细胞生产香草醛的方法，其包括：(i)在培养基中培养分离的重组宿主细胞；(ii)向(i)的所述培养基添加异丁香酚以开始所述异丁香酚到所述香草醛的生物转化；以及(iii)从所述培养基中提取所述香草醛，其中所述分离的重组宿主细胞已经用包含编码异丁香酚单加氧酶的多核苷酸序列的核酸构建体转变，其中所述异丁香酚单加氧酶具有与SEQ ID NO:2具有至少70％同一性的氨基酸序列。12.根据权利要求11所述的方法，其中所述异丁香酚单加氧酶具有与SEQ ID NO:2具有至少80％同一性的氨基酸序列。13.根据权利要求11所述的方法，其中所述异丁香酚单加氧酶具有与SEQ ID NO:2具有至少90％同一性的氨基酸序列。14.根据权利要求11所述的方法，其中所述异丁香酚单加氧酶具有与SEQ ID NO:2具有至少95％同一性的氨基酸序列。15.一种制作消耗品的方法，其包括以下步骤：根据权利要求1所述的方法生产香草醛；收集所述香草醛；以及将所述香草醛掺入消耗品中。16.根据权利要求15所述的方法，其包括：将所述香草醛与所述消耗品掺和的步骤。17...

【专利技术属性】
技术研发人员：R，
申请(专利权)人：巴斯夫欧洲公司，
类型：发明
国别省市：