一种通过注射Podocan蛋白促进小鼠骨骼肌损伤再生的方法技术

一种通过注射Podocan蛋白促进小鼠骨骼肌损伤再生的方法，属于细胞生物学技术领域，主要包括三个方面的内容：首先是Podocan表达载体的构建，其次是Podocan表达载体的转染、Podocan蛋白纯化及鉴定，第三是注射Podocan蛋白对小鼠骨骼肌损伤再生影响的检测，其特征在于：所述的Podocan表达载体的核苷酸序列如Seq ID No:1所示，Podocan蛋白注射可以在肌纤维中有效表达，表达Podocan可以促进小鼠骨骼肌损伤再生。本发明专利技术制作简单，可操作性强，成本低廉，效果明显。效果明显。效果明显。

【技术实现步骤摘要】
一种通过注射Podocan蛋白促进小鼠骨骼肌损伤再生的方法


[0001]本专利技术涉及一种一种通过注射Podocan蛋白促进小鼠骨骼肌损伤再生的方法，属于细胞生物学


技术介绍

[0002]骨骼肌肌纤维组成，这些纤维被基底层包围，由高度有序的细胞外基质(the extracellular matrix，ECM)组织在一起。多种原因可能造成骨骼肌的损伤，它的再生主要依赖位于肌膜和基底膜之间未分化的肌卫星细胞，又称肌原前体细胞。当骨骼肌损伤后，静息的卫星细胞被激活，迁移到损伤部位，细胞发生增殖、分化、融合成为肌管。一部分卫星细胞将恢复静止并能够对随后的肌肉损伤做出反应，维持肌肉稳定性。所以肌肉卫星细胞的分化对于新肌纤维的形成至关重要。肌肉损伤再生后细胞的增殖和分化受一些基因及转录调节因子时序性表达的调控。其中PAX7是卫星细胞出生后存活所需的，接下来是MyoD及MyoG的表达。ECM分子作为细胞生存微环境成分对细胞的增殖、迁移和分化具有十分重要的作用。近来发现ECM中一类小而富含亮氨酸重复序列的糖蛋白家族(small leucine
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rich repeatprotein，SLRP)对细胞的增殖和分化具有重要的调控作用。SLRP家族共有五类成员，其中第一类和第二类研究较多。Podocan基因是SLRP家族的第五类成员，关于其在骨骼肌中的作用未见报道。Podocan属于ECM成分中SLRP家族成员，大约由600个氨基酸组成的分泌型蛋白。在小鼠多种组织中均有表达。本实验前期报道研究表明Podocan促进小鼠C2C12细胞和牛肌肉卫星细胞分化。随着小鼠骨骼肌损伤修复的进行Podocan的表达呈现先增加后减少的趋势，并且与肌肉卫星细胞分化标志基因MyoD的表达呈现相关性，因此，Podocan对小鼠骨骼肌损伤再生有没有作用成为一个急需解决的难题？所以，首先根据Podocan是一种分泌蛋白的性质，构建了体外表达Podocan的His标签载体，转染293T细胞后进行蛋白纯化，获得高浓度Podocan蛋白。随后，在小鼠肌肉损伤再生的同时注射Podocan蛋白，利用HE染色检测小鼠骨骼肌损伤后肌纤维的修复，接着，利用Western blotting检测注射Podocan蛋白后的肌肉卫星细胞标志基因Pax7及分化标志基因MyoD的表达，结果表明注射Podocan蛋白后，肌纤维损伤修复的速度变快，Pax7及MyoD的表达较未注射Podocan蛋白组呈现先增加的趋势，从而达到注射Podocan蛋白促进小鼠骨骼肌损伤再生的目的，专利技术一种通过注射Podocan蛋白促进小鼠骨骼肌损伤再生的方法是必要的。

技术实现思路

[0003]为了解决如何验证Podocan对小鼠骨骼肌损伤再生有没有作用的难题，本专利技术提供了一种通过注射Podocan蛋白促进小鼠骨骼肌损伤再生的方法，该一种通过注射Podocan蛋白促进小鼠骨骼肌损伤再生的方法首先根据Podocan是一种分泌蛋白的性质，构建了体外表达Podocan的His标签载体，转染293T细胞后进行蛋白纯化，获得高浓度Podocan蛋白。随后，在小鼠肌肉损伤再生的同时注射Podocan蛋白，利用HE染色检测小鼠骨骼肌损伤后肌纤维的修复，接着，利用Western blotting检测注射Podocan蛋白后的肌肉卫星细胞标志基
因Pax7及分化标志基因MyoD的表达，结果表明注射Podocan蛋白后，肌纤维损伤修复的速度变快，Pax7及MyoD的表达较未注射Podocan蛋白组呈现先增加的趋势，从而达到注射Podocan蛋白促进小鼠骨骼肌损伤再生的目的。
[0004]本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0005]本专利技术一种通过注射Podocan蛋白促进小鼠骨骼肌损伤再生的方法的具体实验方法及实验结果主要包括三个方面的内容：首先是Podocan表达载体的构建，其次是Podocan表达载体的转染、Podocan蛋白纯化及鉴定，第三是注射Podocan蛋白对小鼠骨骼肌损伤再生影响的检测：
[0006]1.Podocan表达载体的构建
[0007]为了体外高效纯化Podocan蛋白，首先对Podocan表达载体的cDNA序列进行改造并人工合成。Podocan表达载体的核苷酸序列如Seq ID No:1所示。
[0008]2.Podocan表达载体的转染、Podocan蛋白纯化及鉴定
[0009]将上述构建的Podocan表达载体利用PEI转染试剂转染293T细胞，利用真核细胞表达体系完成体外Podocan蛋白的表达，收集培养液，进行蛋白纯化并利用BCA试剂盒测得Podocan的蛋白浓度。具体实验方法如下：
[0010]细胞转染：用去内毒素质粒提取试剂盒提取带有上述序列的质粒。利用聚乙烯亚胺(PEI)作为转染试剂，opti孵育液孵育质粒。转染前将293T细胞传代至10mm
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10mm的细胞培养皿中，完全贴壁生长至80％～90％融合时，按照PEI转染操作步骤将质粒转染细胞，转染72h后收集细胞培养液。
[0011]蛋白纯化及浓度测定：收集的293T细胞培养液经过镍柱亲和分离柱对Podocan蛋白进行回收，最后利用PBS洗脱Podocan蛋白，放入
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80℃超低温冰箱保存。利用BCA法试剂盒，根据说明书要求步骤利用分光光度计测得BSA标准品的吸光度，绘制出标准曲线。依据标准曲线和样品的吸光值与稀释倍数计算得出样品蛋白的浓度。最终测得的样品蛋白浓度为：4.456mg/ml。
[0012]蛋白鉴定：为明确得到的蛋白样品是否为Podocan蛋白，利用Wetsern blotting检测样品中蛋白的浓度。实验步骤简述如下:取上述样品及未进行蛋白纯化的293T细胞培养液(阳性对照)20微升作为蛋白样品，加入上样buffer，煮沸并离心待用。配置分离胶及浓缩胶后进行上样，转膜，封闭后利用Podocan抗体进行孵育过夜后二抗孵育并曝光，比对两个样品中Podocan蛋白浓度及条带大小。结果如图2所示，纯化后蛋白大小为69KDa与说明书一致(1A)，并且纯化后蛋白浓度显著提高(1B)。
[0013]3.注射Podocan蛋白对小鼠骨骼肌损伤再生影响的检测
[0014]取4
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6周龄体重20g左右的ICR小鼠，向左腿胫骨前肌注射0.5％盐酸布比卡因(对照组)，右腿在注射等量的0.5％盐酸布比卡因及50μg Podocan蛋白(实验组)。分别于注射后的0天(0D)、1天(1D)、3天(3D)、5天(5D)、7天(7D)收集骨骼肌组织。首先进行利用骨骼肌组织进行横切，获得组织石蜡切片进行HE染色，观察肌纤维修复的速度。结果如图3，在对照组中小鼠肌纤维在损伤3D时骨骼肌溶解严重，5D部分肌纤维修复。但在实验组中，注射Podocan蛋白后小鼠在损伤3D时肌纤维有部分修复，并且在损伤5D使肌纤维全部修复，且新形成的肌纤维之间的空隙比对照组更小。表明Podocan可以有效加快骨骼肌损伤修复的速度。<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种通过注射Podocan蛋白促进小鼠骨骼肌损伤再生的方法，主要包括三个方面的内容：首先是Podocan表达载体的构建，其次是Podocan表达载体的转染、Podocan蛋白纯化及鉴定，第三是注射Podocan蛋白对小鼠骨骼肌损伤再生影响的检测，其特征在于：所述的Podocan表达载体的核苷酸序列如Seq ID No:1所示。2.根据权利要求1所述的一种通过注射Podocan蛋白促进小鼠骨骼肌损伤再生的方法，其特征在于：所述的Podocan表达载体的转染、Podocan蛋白纯化及鉴定具体实验方法为：将权利要求1所构建的Podocan表达载体利用PEI转染试剂转染293T细胞，利用真核细胞表达体系完成体外Podocan蛋白的表达，收集培养液，进行蛋白纯化并利用BCA试剂盒测得Podocan的蛋白浓度；细胞转染：用去内毒素质粒提取试剂盒提取带有上述序列的质粒；利用聚乙烯亚胺(PEI)作为转染试剂，opti孵育液孵育质粒；转染前将293T细胞传代至10mm
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10mm的细胞培养皿中，完全贴壁生长至80％～90％融合时，按照PEI转染操作步骤将质粒转染细胞，转染72h后收集细胞培养液；蛋白纯化及浓度测定：收集的293T细胞培养液经过镍柱亲和分离柱对Podocan蛋白进行回收，最后利用PBS洗脱Podocan蛋白，放入
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80℃超低温冰箱保存；利用BCA法试剂盒，根据说明书要求步骤利用分光光度计测得BSA标准品的吸光度，绘制出标准曲线；依据标准曲线和样品的吸光值与稀释倍数计算得出样品蛋白的浓度；最终测得的样品蛋白浓度为：4.456mg/ml；蛋白鉴定：为明确得到的蛋白样品是否为Podocan蛋白，利用Wetsernblotting检测样品中蛋白的浓度；实验步骤简述如下:取上述样品及未进行蛋白纯化的293T细胞培养液(阳性对照)20微升作为蛋白样品，加入上样buffer，煮沸并离心待用；配置分...

【专利技术属性】
技术研发人员：李爽，滕怀昕，李树峰，严云勤，佟慧丽，任鹏，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：