松材线虫核酸检测用的PCR试剂盒及检测方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体是指松材线虫核酸检测用的PCR试剂盒及检测方法，包括待测模板、对照模板、检测引物对以及荧光探针，所述检测引物包括上游引物A和下游引物A，其中，所述上游引物A的核苷酸序列为：5

【技术实现步骤摘要】
松材线虫核酸检测用的PCR试剂盒及检测方法


[0001]本专利技术涉及生物检测
，具体是指松材线虫核酸检测用的PCR试剂盒及检测方法。

技术介绍

[0002]从21世纪初开始，随着分子生物学技术的发展与应用，松材线虫检测、检疫技术取得了突飞猛进的发展。基于生物化学技术、生物电学技术和生物信息技术的RAPD和PCR等新型检测工具得以应用，快速检测试剂盒技术、免疫诊断技术、诱集管捕获诊断技术等新方法、新技术也应运而生。与传统方法相比，新技术的开发与应用大大提高了检疫效率和准确性。然而，目前很多检验、检疫方法由于受到条件和技术的限制，或由于方法尚不完善，离大范围推广应用还有一定的距离。
[0003]目前市面上缺少一种操作简便、快速高效的手段来应对日益严重的松材线虫病灾害。

技术实现思路

[0004]本专利技术目的在于提供松材线虫核酸检测用的PCR试剂盒及检测方法，用于通过双基因联合快速检测的方式来进行松材线虫的检测。
[0005]本专利技术通过下述技术方案实现：松材线虫核酸检测用的PCR试剂盒，包括待测模板、对照模板、检测引物对以及荧光探针，所述检测引物包括上游引物A和下游引物A，其中，所述上游引物A的核苷酸序列为：5
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GTGCGTATTCAGCCTTCTGG
‑3’
；所述下游引物A的核苷酸序列为：5
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GCGCACTCCGTACGCAA
‑3’
；所述荧光探针的序列号为：5
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CGGCAATGCACAAACACCA
‑3’
。需要说明的是，由于病原体松材线虫与低致病性的拟松材线虫及其近缘种之间在形态学上很难区分，用形态学方法鉴定容易造成误判、漏判，所以形态学鉴定方法逐渐被淘汰，随着分子生物学的发展，PCR、实时荧光定量PCR等分子诊断方法被应用到松材线虫的检测上，提高了松材线虫检测的准确性。但是，这些方法依然存在着很多的缺点，如耗时长、操作繁琐以及需要昂贵的热循环仪器等，并且非实时荧光定量检测的分子诊断方法需要开盖检测，容易造成污染，需要在专门的实验室中操作。基于上述问题，提出了一种松材线虫核酸检测用的PCR试剂盒，通过对松材线虫基因的特定区域进行的特异性引物的设计，并结合基于松材线虫核糖体DNA的内转录区序列引物对，成功建立了松材线虫双基因联合快速检测体系，该反应体系简单，通过双特异性引物的扩增检测，当任意一对特异性引物反应便能实现松材线虫的精准检测。
[0006]进一步地，所述检测引物还包括上游引物B和下游引物B，所述上游引物B的核苷酸序列为：5
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CGAGCAGAAACGCCGACTT
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；所述下游引物B的核苷酸序列为：5
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AACAAACCGCAGCCAGGACTC
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。
[0007]进一步地，PCR试剂盒还包括：DNA裂解提取液、tap酶、dNTP以及ddH20，其中，tap酶：浓度5u/μl，包括10
×
PCRBuffer、25mmol/LMgCl2；
进一步地，所述DNA裂解提取液包括：125mmol/L的KCl；25mmol/L的Tirs
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HCL；3.75mmol/L的MgCl2；2.5mmol/L的DTT；以及质量分数为1.125%的Tween20。
[0008]进一步地，所述对照模板包括：阳性对照：含有松材线虫BxS1基因DNA片段的质粒，0.5mL/管分装；阴性对照：无菌双蒸水。
[0009]松材线虫核酸检测用的检测方法，包括以下步骤：步骤1，提取待测模板的DNA；步骤2，步骤1提取完成后，用所述上游引物A、下游引物A建立PCR扩增体系进行PCR扩增，或用所述上游引物B、下游引物B建立PCR扩增体系进行PCR扩增；步骤3，步骤2完成后，根据质控标准分析步骤2中的检测结果，其中，若所述待测模板的扩增产物在264bp或490bp处出现扩增带，则含有松材线虫，反之，则没有松材线虫。
[0010]进一步地，步骤2扩增循环参数为：第一阶段，94℃、2分钟；第二阶段，94℃、30s；54℃、30s；72℃、2分钟；循环35次。
[0011]本专利技术与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：1、本专利技术通过对松材线虫基因的特定区域进行的特异性引物的设计，并结合基于松材线虫核糖体DNA的内转录区序列引物对，成功建立了松材线虫双基因联合快速检测体系，该反应体系简单，通过双特异性引物的扩增检测，当任意一对特异性引物反应便能实现松材线虫的精准检测；2、本专利技术通过将含有松材线虫BxS1基因DNA片段的质粒作为PCR检测的靶序列，实现了对DNA和RNA的同时检测，进而提高了该方法的检测能力。
附图说明
[0012]此处所说明的附图用来提供对本专利技术实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本专利技术实施例的限定。在附图中：图1为本专利技术方法的流程示意图；图2为部分检测结果统计表。
具体实施方式
[0013]为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本专利技术作进一步的详细说明，本专利技术的示意性实施方式及其说明仅用于解释本专利技术，并不作为对本专利技术的限定。需要说明的是，本专利技术已经处于实际研发使用阶段。
[0014]实施例1：本专利技术涉及的原材料及制备：1、KCl，分析纯，含量不低于99.5%，杂质最高含量合格；2、Tirs
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HCL，分析纯；3、MgCl2，分析纯，含量不低于99%，水溶液反应合格，杂质最高含量合格；4、DTT，分析纯；5、Tween20，分析纯；6、合成的检测引物及荧光探针。
[0015]松材线虫核酸检测用的PCR试剂盒，包括待测模板、对照模板、检测引物对以及荧光探针，所述检测引物包括上游引物A和下游引物A，其中，所述上游引物A的核苷酸序列为：
5
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GTGCGTATTCAGCCTTCTGG
‑3’
；所述下游引物A的核苷酸序列为：5
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GCGCACTCCGTACGCAA
‑3’
；所述荧光探针的序列号为：5
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CGGCAATGCACAAACACCA
‑3’
。需要说明的是，由于病原体松材线虫与低致病性的拟松材线虫及其近缘种之间在形态学上很难区分，用形态学方法鉴定容易造成误判、漏判，所以形态学鉴定方法逐渐被淘汰，随着分子生物学的发展，PCR、实时荧光定量PCR等分子诊断方法被应用到松材线虫的检测上，提高了松材线虫检测的准确性。但是，这些方法依然存在着很多的缺点，如耗时长、操作繁琐以及需要昂贵的热循环仪器等，并且非实时荧光定量检测的分子诊断方法需要开盖检测，容易造成污染，需要在专门的实验室中操作。
[0016]基于上述问题，提出了一种松材线虫核酸检测用的PCR试剂盒，通过对松材线虫基因的特定区域进行的特异性引物的设计，并结合基于松材线本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.松材线虫核酸检测用的PCR试剂盒，其特征在于：包括待测模板、对照模板、检测引物对以及荧光探针，所述检测引物包括上游引物A和下游引物A，其中，所述上游引物A的核苷酸序列为：5
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GTGCGTATTCAGCCTTCTGG
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；所述下游引物A的核苷酸序列为：5
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GCGCACTCCGTACGCAA
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；所述荧光探针的序列号为：5
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CGGCAATGCACAAACACCA
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。2.根据权利要求1所述的松材线虫核酸检测用的PCR试剂盒，其特征在于：所述检测引物还包括上游引物B和下游引物B，所述上游引物B的核苷酸序列为：5
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CGAGCAGAAACGCCGACTT
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；所述下游引物B的核苷酸序列为：5
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AACAAACCGCAGCCAGGACTC
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。3.根据权利要求1所述的松材线虫核酸检测用的PCR试剂盒，其特征在于：PCR试剂盒还包括：DNA裂解提取液、tap酶、dNTP以及ddH20，其中，tap酶：浓度5u/μl，包括10
×
PCRBuffer、...

【专利技术属性】
技术研发人员：周晓奎，宋海亮，周洪垒，赵云，
申请(专利权)人：四川杰莱美科技有限公司，
类型：发明
国别省市：