一种诱导性释放CBLB502的CAR-NK细胞及其制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及嵌合抗原受体修饰免疫细胞疗法技术领域，具体涉及一种诱导性释放CBLB502的CAR

【技术实现步骤摘要】
一种诱导性释放CBLB502的CAR
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NK细胞及其制备方法与应用


[0001]本专利技术涉及嵌合抗原受体修饰免疫细胞疗法
，具体涉及一种诱导性释放CBLB502的CAR
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NK细胞及其制备方法与应用。

技术介绍

[0002]随着研究的进展，免疫疗法与手术、化疗及放疗一样，被认为是肿瘤治疗的重要支柱，为癌症患者带来新的希望。其中，CAR
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T细胞疗法(Chimeric Antigen Receptor T
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Cell Immunotherapy)是一种精准靶向免疫疗法，该疗法是通过基因工程手段对T细胞进行修饰，在体外进行大量的扩增，表达具有识别肿瘤细胞抗原能力的特异性受体，然后应用到患者体内来靶向杀伤肿瘤细胞。嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor，CAR)主要由细胞外抗原识别域、T细胞受体跨膜和铰链域及细胞内信号转导域三部分组成。CAR
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T细胞疗法的基本原理是通过其受体特异性识别肿瘤相关抗原(TAA)，并通过信号转导和铰链域将信号传导至胞内从而激活T细胞，引起特异性免疫应答来杀伤肿瘤细胞。由于CAR
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T细胞抗原识别基于其表达的单链可变片段与肿瘤表面抗原的结合，因此不受组织相容性复合体(MHC)限制，也不依赖于抗原的加工与呈递。
[0003]然而，CAR
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T对于实体肿瘤的治疗效果却比较有限，原因在于缺乏理想的靶向肿瘤抗原；CAR
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>T细胞在体内的持久性和增殖受限；治疗后无法避免的复发及肿瘤特殊的免疫抑制微环境的影响。许多临床前研究正在探索克服上述挑战和提高CAR
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T细胞在实体恶性肿瘤中的疗效的策略。采用其他免疫细胞代替T细胞作为CAR载体，也是克服CAR
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T细胞治疗出现的抗原阴性肿瘤细胞免疫逃逸现象的策略。其中，自然杀伤细胞(NK细胞)作为天然免疫细胞，其杀伤肿瘤细胞活性不依赖于抗原识别，而是可通过调节激活和抑制受体的平衡或者释放颗粒酶等毒性颗粒才发挥抗瘤活性。因此，NK细胞有利于杀伤靶抗原阴性表达的肿瘤细胞。另外，NK细胞作为CAR载体的另一个好处是来源丰富，容易获取。如NK92细胞系是目前唯一一株被临床批准可在体内应用的细胞系。针对不同靶点的嵌合抗原受体修饰的NK92细胞也被证实具有有效杀伤肿瘤细胞活性。CAR
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NK是将嵌合抗原受体(Chimeric antigen receptor，CAR)表达于NK细胞中，使之能通过CAR依赖的机制杀伤表达肿瘤相关抗原的靶细胞。与CAR
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T细胞相比，CAR
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NK细胞作用更广，不良反应更小，因此NK细胞是CAR的更优负载细胞。
[0004]专利技术人尝试将CAR整合于NK细胞中，用于结直肠癌的治疗，但是，由于适当的CAR
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NK细胞疗法的结直肠癌治疗靶点尚未明确，并且现有技术的嵌合抗原受体的NK
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92细胞(CAR
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NK细胞)仍然存在免疫细胞无法充分地激活的问题。亟需对结直肠癌的CAR
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NK细胞疗法的治疗靶点进行进一步研究，以及找到一种能够有效充分激活NK细胞的活性的方法。

技术实现思路

[0005]本专利技术意在提供一种诱导性释放CBLB502的CAR
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NK细胞，以解决现有技术的CAR
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NK细胞针对结直肠癌等实体瘤的治疗效果有限的技术问题。
[0006]为达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0007]一种诱导性释放CBLB502的CAR
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NK细胞，其包括细胞膜上整合有CAR133嵌合抗原受体的能够分泌CBLB502蛋白的自然杀伤细胞。
[0008]本方案还提供了一种诱导性释放CBLB502的CAR
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NK细胞在制备治疗肿瘤的药物中的应用。
[0009]本方案的原理及优点是：
[0010]临床上使用的CAR
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T/NK细胞(嵌合抗原受体胸腺淋巴细胞，或者嵌合抗原受体自然杀伤细胞)仅仅在血液系统恶性肿瘤患者的治疗中获得了显著的治疗疗效，对于实体肿瘤的治疗效果有限，其原因包括缺乏理想的靶向肿瘤抗原，CAR
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T/NK细胞在体内的持久性和增殖受限，以及肿瘤特殊的免疫抑制微环境的影响等。本方案为克服上述CAR
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T/NK细胞对于实体肿瘤治疗的缺陷，将免疫激动剂CBLB502与CAR133
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NK92细胞共表达，成功构建诱导性释放CBLB502的CAR
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NK细胞(本技术方案具体为：CAR133
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i502
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NK92细胞)，在CAR133
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NK92细胞杀伤抗原阳性肿瘤细胞的同时释放CBLB502。CBLB502可以诱导活化NK细胞，促进NK细胞增殖，还可以诱导内源性免疫细胞(非CAR133
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NK92细胞)杀伤抗原阴性肿瘤细胞，从而增强CAR
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NK92细胞免疫疗法在实体瘤中的应用疗效。专利技术人进行了CAR133
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i502
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NK92细胞杀瘤活性分析：采用与肿瘤细胞共培养的方法，在体外元整CAR133
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NK92对于肿瘤细胞的杀伤活性；利用皮下注射CD133阳性肿瘤细胞的方法建立小鼠肿瘤模型，在体内验证CAR133
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i502
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NK92细胞的杀瘤活性。实验证明，无论是体内还是体外，相比于CAR133
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NK92细胞与NK92细胞，CAR133
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i502
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NK92细胞对CD133阳性肿瘤细胞都具有更强的杀伤能力。因此，添加诱导性释放免疫激动剂CBLB502的表达框，能够显著增强CAR133
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NK92细胞的增殖与活化，也能够显著增强CAR133
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NK92细胞在体内外对于肿瘤细胞的杀伤活性。
[0011]除此之外，本技术方案使用CD133蛋白作为结直肠癌治疗靶点，可以有效靶向结直肠癌细胞，而对实验动物的其他组织(例如胃组织)没有破坏作用。专利技术人利用免疫组化，分析结直肠癌患者的癌组织中CD133蛋白表达，同时也对CD133蛋白在人体正常组织中的表达情况进行分析。在结直肠癌患者中，相比较癌旁组织，所有结直肠癌样本中表现为CD133阳性表达。在健康人中，大多数组织均呈现CD133阴性表达。相比他组织，胃组织中CD133蛋白表达为阳性，提示利用CD133蛋白为靶点治疗结直肠癌时，可能会存在对胃组织的靶向
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非瘤的毒副反应。但是，使用CAR133
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i502
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NK92细胞处理结直肠癌本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种诱导性释放CBLB502的CAR
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NK细胞，其特征在于，其包括细胞膜上整合有CAR133嵌合抗原受体的能够分泌CBLB502蛋白的自然杀伤细胞。2.根据权利要求1所述的一种诱导性释放CBLB502的CAR
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NK细胞，其特征在于，CAR133嵌合抗原受体的序列包括如SEQ ID NO.3所示的CD133抗体的scfv序列。3.根据权利要求2所述的一种诱导性释放CBLB502的CAR
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NK细胞，其特征在于，CAR133嵌合抗原受体的序列还包括如SEQ ID NO.4所示的CD8α铰链序列、如SEQ ID NO.5所示的跨膜结构域序列、如SEQ ID NO.6所示的共刺激分子4
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1BB序列和如SEQ ID NO.7所示的CD3ζ信号域序列。4.根据权利要求1所述的一种诱导性释放CBLB502的CAR
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NK细胞，其特征在于，所述CBLB502蛋白的表达受序列如SEQ ID NO.11所示的启动子控制。5.根据权利要求1所述的一种诱导性释放CBLB502的CAR
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NK细胞，其特征在于，其由如下方法制备而成：S1基因合成：合成序列如SEQ ID NO.1所示的CAR133嵌合抗原受体基因；合成序列如SEQ ID NO.2所示的含有启动...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘昊宇，邵文陶，李伟强，龙皎月，
申请(专利权)人：重庆睿仕康生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：