梨PpPOD基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了梨PpPOD基因及其应用。在梨果肉中沉默表达PpPOD基因，可以起到降低苹果酸和柠檬酸的含量的作用。梨PpPOD基因可在梨果实风味调控中发挥重要作用，可以应用于梨果实酸味口感性状的遗传改良。实酸味口感性状的遗传改良。实酸味口感性状的遗传改良。

【技术实现步骤摘要】
梨PpPOD基因及其应用


[0001]本专利技术属于植物分子生物技术和基因工程领域，具体涉及梨PpPOD基因及其应用。

技术介绍

[0002]梨是中国第三大果树，增强梨果实风味物质是提高其内在品质的重要物质基础。风味物质不仅包含糖分含量和芳香物质水平，酸组分含量也是评价梨果实风味品质的重要指标。苹果酸和柠檬酸被认为是梨果最主要的有机酸，在决定梨果酸味口感中起到重要的影响。然而，由于梨树童期长且遗传上高度杂合，采用传统育种手段选育新品种进程缓慢。挖掘风味物质相关基因资源，利用生物技术加速育种效率是有效的技术手段。
[0003]苯丙烷合成途径上的过氧化酶(peroxidase)基因POD被报道在植物体内发挥抗氧化作用的功能，主要参与到激素代谢、木质素合成和响应逆境胁迫等生物过程。然而POD基因能够影响果实有机酸含量的作用还未见报道。目前在梨领域，利用基因工程技术调控有机酸的报道较少，可供选择的基因也极其有限，阻碍了利用分子生物学技术调控有机酸含量的目的。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供梨POD基因(命名为PpPOD)及其应用。本专利技术为调节梨果实苹果酸和柠檬酸含量提供了可选择的候选基因，在调控梨果实风味方面具有较好的应用前景。
[0005]本专利技术根据梨基因组(http://peargenome.njau.edu.cn)信息，分离到一个梨过氧化酶基因PpPOD，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，序列长度为1011bp，编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，长度是336个氨基酸。
[0006]采用VIGS的技术手段，利用同源重组的方法将PpPOD基因靠近C端的505bp片段插入到pTRV2载体中，形成PpPOD
‑
pTRV2重组载体。利用瞬时转化的方法在梨果肉中沉默PpPOD基因的表达，可有效降低果肉中的苹果酸和柠檬酸含量。
[0007]本专利技术的梨过氧化酶基因PpPOD是梨果肉有机酸含量的正调控因子，通过基因工程技术超量表达或沉默该基因表达可分别达到促进或抑制苹果酸和柠檬酸的含量的效果，从而在调控梨果有机酸含量中发挥重要作用。
[0008]因此，本专利技术的第一个目的是提供梨PpPOD基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0009]本专利技术的第二个目的是提供所述的梨PpPOD基因编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0010]本专利技术还提供含有所述的梨PpPOD基因的沉默表达载体。
[0011]优选，所述的沉默表达载体为重组载体PpPOD
‑
pTRV2，是利用同源重组的方法将PpPOD基因片段连接在pTRV2载体上得到的。
[0012]本专利技术还提供所述的梨PpPOD基因或其蛋白、或含有所述的梨PpPOD基因的沉默表
达载体在调控梨果实有机酸含量中的应用。
[0013]优选，所述的应用，为沉默表达梨PpPOD基因在降低梨果实有机酸含量中的应用。
[0014]优选，所述的有机酸为苹果酸和柠檬酸。
[0015]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
[0016]本专利技术公开了调控梨果实有机酸的PpPOD基因及其应用。在梨果实中沉默表达PpPOD基因，可以起到降低梨果实苹果酸和柠檬酸含量的作用。抑制表达该基因获得了抑制苹果酸和柠檬酸积累的转基因梨果实。也可以通过基因工程技术超量表达PpPOD基因达到促进梨果实苹果酸和柠檬酸的含量的效果。因此梨PpPOD基因及其编码蛋白可以应用于梨果实遗传改良。
附图说明
[0017]图1是PpPOD
‑
TRV梨果沉默表达系(转基因系数量＝6)与空载对照系(转基因系数量＝6)pTRV2的果肉有机酸含量进行比较，发现PpPOD
‑
TRV梨果沉默表达系的苹果酸和柠檬酸(梨果有机酸最主要的组分)含量显著低于对照系。
具体实施方式
[0018]以下实施例是对本专利技术的进一步说明，而不是对本专利技术的限制。
[0019]实施例1：梨PpPOD基因的分离与克隆
[0020]1.PpPOD引物合成：利用梨基因组数据库(http://peargenome.njau.edu.cn)中的PpPOD序列信息，分别设计克隆PpPOD基因的引物(正向引物：5
’‑
ATGGCTTCTTCTTCTTCTTCC
‑3’
，反向引物：5
’‑
CTAGTCCCGGATTTTATTG
‑3’
)。
[0021]2.梨果肉总RNA提取及第一条cDNA链合成：利用RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(Tiangen,China)，根据试剂盒说明书提取梨果肉总RNA。将质量检测合格的RNA用RevertAid
TM First Strand cDNASynthesis Kit(Fermenta,USA)试剂盒进行cDNA第一条链的合成，
‑
20℃保存备用。
[0022]3.PpPOD基因的扩增与检测：以梨cDNA为模板，利用PpPOD基因的克隆引物，采用Phanta Max Super
‑
Fidelity DNA Polymerase(高保真酶，PCR扩增方法根据试剂盒说明书)扩增基因序列。电泳检测到目的条带后，回收PCR产物并与pTOPO
‑
BLUNT Simple Vector连接。转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，检测到阳性菌落后进一步测序验证(武汉天一辉远生物技术有限公司完成)。
[0023]结果分析：测序结果显示，PpPOD的cDNA序列如SEQ ID NO.1所示，序列长度为1011bp；编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，序列长度为336aa。
[0024]实施例2：PpPOD基因的功能验证
[0025]1.载体的构建：利用同源重组的技术将PpPOD重组到pTRV2载体上。具体为：提取实施例1中测序正确的菌液质粒，以此为模板用PpPOD基因片段的特异引物(PbPOD
‑
TRV
‑
F：GCCTCCATGGGGATCCATACCTTCCTGACCACAATGAGAG和PbPOD
‑
TRV
‑
R：ATGCCCGGGCCTCGAGCTAGTCCCGGATTTTATTGGCAACAT)来完成PCR反应，获得PpPOD基因的PCR片段。PCR反应程序为：98℃预变性2min；35次循环(98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸30s)；72℃延伸10min。PCR反应程序结束后，电泳检测扩增的条带是否与预期相符。提取pTRV2载体质粒，利用双酶切的方
法(BamHI和Xhol)使载体线性化完全。利用胶回收试剂盒纯化线性化的pTRV2载体和PpPOD基因的PCR片段。按照如下反应体系(表1)将PpPOD基因片段连本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.梨PpPOD基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.权利要求1所述的梨PpPOD基因编码的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.一种含有权利要求1所述的梨PpPOD基因的沉默表达载体。4.根据权利要求3所述的沉默表达载体，所述的沉默表达载体为重组载体PpPOD
‑
pTRV2，是利用同源重组...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘政，伍涛，李谢雨，杨立，程寅胜，聂显双，李先明，涂俊凡，杨夫臣，朱红艳，夏强明，
申请(专利权)人：湖北省农业科学院果树茶叶研究所，
类型：发明
国别省市：