一种利用枯草芽孢杆菌制备碱性蛋白酶的方法和应用技术

本发明专利技术提供了一株枯草芽孢杆菌在制备碱性蛋白酶中的应用，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)TJD

【技术实现步骤摘要】
一种利用枯草芽孢杆菌制备碱性蛋白酶的方法和应用


[0001]本申请涉及微生物发酵
，尤其涉及一种利用枯草芽孢杆菌制备碱性蛋白酶的方法和应用。

技术介绍

[0002]蛋白酶是水解蛋白质肽链的一类酶的总称，是一种重要的工业化应用的酶制剂，按其反应最适pH可以分为碱性、中性和酸性蛋白酶。
[0003]碱性蛋白酶，指的是在碱性条件下能够水解蛋白质肽键的酶，可水解肽键、酯键、酰胺键，是一种无毒、无副作用的蛋白质。碱性蛋白酶广泛存在于动、植物及微生物中，微生物来源的蛋白酶与动、植物来源的碱性蛋白酶相比，具有成本低、容易制备、适合大规模生产等优势，因此，微生物一直是碱性蛋白酶生产的重要来源。
[0004]目前用于工业化生产的菌种主要为芽孢杆菌，如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌，嗜碱性芽孢杆菌等，酶产量和其酶学性质仍不能满足现代工业发展的需求，生产碱性蛋白酶的产酶效率和酶的活性及酶解效率仍有待提高。

技术实现思路

[0005]本专利技术的本专利技术的目的之一是提供一株具有较高pH适应性的产生碱性蛋白酶的高产菌株及其培养方法；本专利技术的目的之二是提供一种利用上述菌株TJD
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9生产碱性蛋白酶的方法，其发酵生产的碱性蛋白酶能够在碱性条件下水解多种底物，对植物蛋白、羽毛粉等均有优异的降解效果，也可将其应用于制革浸水、脱毛、软化应用等方面。
[0006]一方面，本申请提供了一株枯草芽孢杆菌在制备碱性蛋白酶中的应用，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)TJD
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9，其保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC1.372。
[0007]其中，枯草芽孢杆菌TJD
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9通过购买获得。
[0008]另一方面，本申请还提供了一种利用枯草芽孢杆菌制备碱性蛋白酶的方法，所述方法包括如下步骤：
[0009]步骤一、将枯草芽孢杆菌接种于种子培养基中，35℃～40℃、180～220rpm摇床培养10～16h，获得枯草芽孢杆菌种子液；
[0010]步骤二、将上述枯草芽孢杆菌种子液接入发酵培养基中，20℃～35℃，100～220rpm摇床培养40～60h，发酵得碱性蛋白酶；
[0011]所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌TJD
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9，其保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC1.372。
[0012]优选的，所述步骤一中培养条件为35℃、180rpm摇床培养12h。
[0013]优选的，所述步骤二中的培养条件为25℃，120rpm摇床培养60h。
[0014]进一步的，所述枯草芽孢杆菌种子液的接种量为5％～10％。
[0015]优选的，所述枯草芽孢杆菌种子液的接种量为8％。
[0016]进一步的，以质量百分比计，所述种子培养基包括：豆饼粉3.5％～4.5％，玉米粉2.5％～3.5％，磷酸氢二钠0.6％～1％，硫酸铵0.4％～0.6％，余量为水；优选的，所述种子培养基pH为6～8。
[0017]优选的，所述种子培养基包括：豆饼粉4％，玉米粉3％，磷酸氢二钠0.8％，硫酸铵0.5％，余量为水。
[0018]更优选的，所述种子培养基pH为6.4。
[0019]在一种优选的实施方式中，所述种子培养基：豆饼粉40.0g，玉米粉30.0g，磷酸氢二钠8.0g，硫酸铵5.0g和蒸馏水1000mL，pH为6.4，121℃灭菌20min制成。
[0020]进一步的，以质量百分比计，所述发酵培养基包括：豆饼粉5％～6％，玉米粉7％～8％，磷酸氢二钠0.6％～1％，硫酸铵0.4％～0.6％，余量为水；优选的，所述发酵培养基pH为5.9～6.0。
[0021]优选的，豆饼粉5.5％，玉米粉7.5％，磷酸氢二钠0.8％，硫酸铵0.5％，余量为水。
[0022]更优选的，所述发酵培养基pH为6.0。
[0023]在一种优选的实施方式中，所述发酵培养基：豆饼粉165g，玉米粉225g，磷酸氢二钠24g，硫酸铵15g和蒸馏水3000mL，pH为6.0，121℃灭菌20min制成。
[0024]优选的，所述方法还包括后处理的步骤，所述后处理的步骤包括：将按步骤二方法获得的碱性蛋白酶发酵液低温离心，除去菌体，用硫酸铵沉淀发酵液中的蛋白，离心，收集沉淀，用磷酸缓冲液溶解沉淀，冷冻干燥至粉末状，得碱性蛋白酶。
[0025]在一种优选的实施方式中，所述后处理的步骤包括：将碱性蛋白酶发酵液在4℃、8000r/min下离心20min，除去菌体，用质量浓度为80％硫酸铵沉淀发酵液中的蛋白，12000r/min下离心20min，收集沉淀，用pH为7.0磷酸缓冲液溶解沉淀，在
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45℃、7Pa压力下冷冻干燥至粉末状，得碱性蛋白酶。
[0026]在一种优选的实施方式中，所述利用枯草芽孢杆菌制备碱性蛋白酶的方法包括如下步骤：
[0027]步骤一、将枯草芽孢杆菌TJD
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9接种于种子培养基中，35℃～40℃、180～220rpm摇床培养10～16h，获得枯草芽孢杆菌种子液；
[0028]步骤二、将上述枯草芽孢杆菌种子液以接种量为5～10％，接入发酵培养基中，20℃～35℃，100～220rpm摇床培养40～60h，发酵得碱性蛋白酶发酵液；
[0029]步骤三、将上述碱性蛋白酶发酵液低温离心，除去菌体，沉淀发酵液中的蛋白，离心，收集沉淀，用缓冲液溶解沉淀，冷冻干燥至粉末状，得碱性蛋白酶。
[0030]另一方面，本申请还提供了一种上述方法制备的碱性蛋白酶，所述碱性蛋白酶酶活大于30000u/mL。
[0031]优选的，所述碱性蛋白酶酶活为30000
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35000u/mL。
[0032]进一步的，所述碱性蛋白酶的酶解条件为30℃～70℃、pH为5～12。
[0033]进一步的，所述碱性蛋白酶的酶解条件为40℃～60℃，pH为6～11。
[0034]优选的，所述碱性蛋白酶的酶解条件为50℃、pH为7～10。
[0035]另一方面，本申请还提供了一种含有上述的碱性蛋白酶的产品。
[0036]另一方面，本申请还提供了如上述发酵方法制备的碱性蛋白酶或如上述的碱性蛋白酶或如上述的产品在水解植物蛋白、水解动物蛋白和/或制革中的应用。
[0037]本专利技术具有如下有益效果：
[0038]1、本申请提供了一株具有较高pH适应性的产生碱性蛋白酶的高产菌株枯草芽孢杆菌TJD
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9及其培养方法，为碱性蛋白酶的生产提供了一种新菌株；
[0039]2、本申请还提供了利用上述菌株TJD
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9生产碱性蛋白酶的方法，该方法简单、周期短、营养需求低、易生产制备、产品质量好、蛋白含量高、有显著的经济和社会效益，制备的碱性蛋白酶发酵液中碱性蛋白酶含量可达到30000～35000u/mL；本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一株枯草芽孢杆菌在制备碱性蛋白酶中的应用，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)TJD
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9，其保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC1.372。2.一种利用枯草芽孢杆菌制备碱性蛋白酶的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：步骤一、将枯草芽孢杆菌接种于种子培养基中，35℃～40℃、180～220rpm摇床培养10～16h，获得枯草芽孢杆菌种子液；步骤二、将上述枯草芽孢杆菌种子液接入发酵培养基中，20℃～35℃，100～220rpm摇床培养40～60h，发酵得碱性蛋白酶；所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌TJD
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9，其保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC1.372。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌种子液的接种量为5％～10％。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，以质量百分比计，所述种子培养基包括：豆饼粉3.5％～4.5％，玉米粉2.5％～3.5％，磷酸氢二钠0.6％～1％，硫...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨雨，宋迪，关志勇，曹新春，郭芳坤，林永康，
申请(专利权)人：山东天润和生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：