一种胭脂萝卜花色苷生物合成和调控方法技术

本发明专利技术公开一种胭脂萝卜花色苷生物合成和调控方法，以胭脂萝卜cDNA为模板克隆扩增并构建RsWRKY44的超表达载体，结果发现RsWRKY44和RsAN1共同表达可诱导花色苷生物合成结构基因和调控基因的表达，进而调控花色苷合成。本发明专利技术发现胭脂萝卜转录组结合共表达网络数据中的一个WRKY转录因子RsWRKY44，其转录水平与不同品种胭脂萝卜花色苷积累和调控基因RsAN1和RsbHLH4表达量呈显著正相关，推测其也参与花色苷的合成，通过构建超表达载体，瞬时表达及荧光定量PCR分析RsWRKY44的功能，为胭脂萝卜花色苷改良及利用基因工程应用该基因提高植物花色苷含量提供理论基础。植物花色苷含量提供理论基础。植物花色苷含量提供理论基础。

【技术实现步骤摘要】
一种胭脂萝卜花色苷生物合成和调控方法


[0001]本专利技术涉及一种胭脂萝卜花色苷生物合成和调控的方法，属于生物合成


技术介绍

[0002]花色苷是一种广泛存在于花卉、蔬果中的天然食用功能性色素，具有多方面生理活性，对人体健康起到积极作用，最新的体内外实验表明花色苷还具有调控尿酸代谢作用。而且天然花色苷不仅具有鲜艳的色调让人喜欢，同时其应用方面也非常的广泛，特别是食品行业，主要应用领域包括饮料和酒类，对果汁饮料、碳酸饮料等产品，可以用花色苷来进行调色；对酒类等相关产品，花色苷可应用于啤酒、果酒、葡萄酒及低酒精饮料中，其稳定性取决于pH值、乙醇含量和糖的浓度，如果把葡萄花色苷添加在葡萄酒中，还可增强葡萄酒抗肿瘤和降低血脂作用。对于植物来说，花色苷发挥其独特的生理功能，可以帮助植物度过不良环境，同时花色苷还有较好的药理活性，常被用于糖尿病、抗炎、预防高血压等方面的治疗。因此，研究花色苷的合成方法显得尤为重要。
[0003]胭脂萝卜是川渝地区的特色蔬菜，因其皮肉富含花色苷而呈现出深红色而闻名，但因在种植过程中部分胭脂萝卜花色苷合成不稳定含量低，造成其经济和营养价值降低。目前，胭脂萝卜花色苷生物合成和调控研究存在一定的瓶颈。

技术实现思路

[0004]针对现有技术存在的上述不足，本专利技术的目的在于提供一种胭脂萝卜花色苷生物合成和调控的方法，解决目前种植过程中胭脂萝卜花色苷合成不稳定含量低的技术问题。
[0005]为了解决上述问题，本专利技术采用如下技术方案：
[0006]一种胭脂萝卜花色苷生物合成和调控方法，以胭脂萝卜cDNA为模板克隆扩增并构建RsWRKY44的超表达载体，利用RsWRKY44和RsAN1共同合成调控花色苷。
[0007]进一步，所述RsWRKY44为通过胭脂萝卜转录组结合共表达网络数据中的一个WRKY转录因子，其转录水平与不同品种胭脂萝卜花色苷积累和调控基因RsAN1和RsbHLH4表达量呈显著正相关。
[0008]相比现有技术，本专利技术有如下有益效果：
[0009]1、本专利技术发现胭脂萝卜转录组结合共表达网络数据中的一个WRKY转录因子RsWRKY44，其转录水平与不同品种胭脂萝卜花色苷积累和调控基因RsAN1和RsbHLH4表达量呈显著正相关，推测其也参与花色苷的合成，通过设计获得含有RsWRKY44的超表达载体，通过烟草遗传转化，瞬时表达及荧光定量PCR分析花色苷合成途径中结构基因的表达等试验，验证试验推测结果正确，为胭脂萝卜花色苷改良提供理论基础。
[0010]2、本专利技术创造性的提出RsWRKY44和RsAN1两个蛋白可以协同调控花色苷的生物合成，解决胭脂萝卜花色苷合成不稳定含量低的问题，为胭脂萝卜花色苷生物合成调控网络提供了新的依据和思路。
附图说明
[0011]图1为RsWRKY44片段扩增PCR凝胶电泳图；其中：M：Marker；1和2：RsWRKY44扩增PCR检测。
[0012]图2为pSAK277
‑
RsWRKY44质粒图谱。
[0013]图3为烟草叶片瞬时表达RsAN1和RsWRKY44诱导花色苷合成情况。
[0014]图4为瞬时表达区域花青素含量。
[0015]图5为瞬时表达注射区域花色苷合成途径相关基因表达分析。
具体实施方式
[0016]以下结合具体实施例，对本专利技术作进一步详细的说明，但本专利技术并不局限于此。
[0017]本专利技术中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本专利技术内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
[0018]除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本专利技术所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本专利技术仅描述了优选的方法和材料，但是在本专利技术的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
[0019]下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和原料，如无特殊说明，均可以从商业途径获得或根据已知的方法制备获得。本专利技术中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
[0020]本专利技术发现胭脂萝卜转录组结合共表达网络数据中的一个WRKY转录因子RsWRKY44，其转录水平与不同品种胭脂萝卜花色苷积累和调控基因RsAN1和RsbHLH4表达量呈显著正相关，推测其也参与花色苷的合成。
[0021]基于此，本专利技术提供一种胭脂萝卜花色苷生物合成和调控的方法，以胭脂萝卜cDNA为模板克隆扩增并构建RsWRKY44的超表达载体，利用RsWRKY44和RsAN1共同合成调控花色苷。
[0022]其中，所述RsWRKY44为通过胭脂萝卜转录组结合共表达网络数据中的一个WRKY转录因子，其转录水平与不同品种胭脂萝卜花色苷积累和调控基因RsAN1和RsbHLH4表达量呈显著正相关。
[0023]实施例
[0024]1.1植物材料
[0025]实验室培育生理状态良好的
‘
W38
’
烟草。
[0026]1.2超表达载体构建
[0027]以胭脂萝卜cDNA为模板，设计特异引物(表1)扩增RsWRKY44片段，根据日本Takara公司的Prime STAR Max DNA Polymerase基因扩增体系(表2)进行扩增。经过PCR检测正确后，纯化回收PCR产物，为后续连接平末端做准备。使用XhoI和EcoRI限制性内切酶双酶切
(表3)具有酶切位点的pSAK277超表达载体，纯化回收线性化载体。将扩增片段与酶切后载体使用上海汉恒公司的HB
‑
INFUSION试剂盒进行Gibson组装，然后转化大肠杆菌，培养24h后挑取长势合格单菌落进行PCR检测，PCR检测正确后选择合格菌液进行过夜扩大培养，第二天根据试剂盒步骤提取质粒送华大基因公司测序。
[0028]表1所用到的引物序列
[0029][0030][0031]表2基因扩增体系
[0032][0033]PCR反应程序：98℃预变性2min，98℃变性10s，55℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环，72℃下终止延伸5min。
[0034]1％琼脂糖凝胶电泳：将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
[0035]表3双酶切反应体系
[0036][0037]1.3重组质粒转化GV3101农杆菌菌株
[0038](1)根据质粒图谱可以确定转化农杆菌时抗性选择盐酸大观霉素，配置含相应抗生素的固液体YEP培养基备用本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种胭脂萝卜花色苷生物合成和调控方法，其特征在于，以胭脂萝卜cDNA为模板克隆扩增并构建RsWRKY44的超表达载体，利用RsWRKY44和RsAN1共同合成调控花色苷。2.根据权利要求1所述胭脂萝卜花色苷生物合...

【专利技术属性】
技术研发人员：赖彪，余艳玲，李艳红，杜丽娜，徐思，杨寒冰，景帆，
申请(专利权)人：长江师范学院，
类型：发明
国别省市：