一种鱼类miRNA及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种鱼类miRNA及其应用，所述鱼类为牙鲆，所述miRNA的名称为pol

【技术实现步骤摘要】
一种鱼类miRNA及其应用


[0001]本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种鱼类miRNA及其应用。

技术介绍

[0002]牙鲆(Paralichthys olivaceus)是我国以及亚洲众多国家的重要经济海水鱼。在养殖过程中，牙鲆极易受到病原菌的感染，导致疾病爆发。鳗弧菌(Vibrio anguillarum)是感染牙鲆的一种主要致病菌，也是危害其他鱼类的病原菌，其引起的弧菌病是最常见的水产动物疾病之一，已经在世界范围内造成了巨大的经济损失。但目前对鱼类抗菌感染的机制不清，仍缺乏有效的鱼类抗菌制剂。
[0003]miRNA是一类长度约22个核苷酸的单链小非编码RNA，其序列在不同物种之间保守度极高。miRNA通过与靶基因3
’
UTR区序列结合，调控靶基因的表达，进而在生长、发育、代谢和免疫等生物过程中起作用。对哺乳动物的免疫研究表明，miRNA可作为癌症诊断和治疗的重要靶点。大量研究结果显示，鱼类miRNA能够参与宿主响应病原微生物感染，miRNA作为鱼类抗菌制剂具有巨大的应用前景，但目前对绝大多数miRNA在响应细菌感染中所行使的具体功能还不明晰。

技术实现思路

[0004]针对现有技术的不足，本专利技术提供一种鱼类miRNA及其应用，为高效增强经济养殖鱼类抗菌免疫能力提供了新途径。
[0005]本专利技术是通过以下技术方案实现的：
[0006]一种鱼类miRNA，所述鱼类为牙鲆，所述miRNA的名称为pol
‑
miR
>‑
n199
‑
3p，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
[0007]上述的鱼类miRNA在制备模拟物中的应用，所述模拟物的序列如SEQ IDNO.1所示。
[0008]上述的鱼类miRNA在制备抗菌制剂中的应用，利用无菌PBS溶液或DEPC水溶解pol
‑
miR
‑
n199
‑
3p的模拟物，配置浓度为20μM。
[0009]优选地，所述抗菌制剂的致病菌为鳗弧菌(Vibrio anguillarum)。
[0010]一种用于牙鲆抗鳗弧菌的抗菌制剂，包括上述的鱼类miRNA的模拟物。
[0011]本专利技术的有益效果如下：
[0012]本专利技术所涉及的pol
‑
miR
‑
n199
‑
3p作为鱼类免疫调节分子，将合成的pol
‑
miR
‑
n199
‑
3p模拟物制备成抗菌制剂，注射鱼体后能够显著(P＜0.05)抑制鳗弧菌感染牙鲆，提高牙鲆的抗菌免疫能力，为高效增强经济养殖鱼类抗菌免疫能力提供了新途径。
附图说明
[0013]图1为实施例2中各实验组的鱼脾脏组织中鳗弧菌负载量；
[0014]图2为实施例2中各实验组的鱼肝脏组织中鳗弧菌负载量。
具体实施方式
[0015]为更清晰地显示本专利技术的技术方案和优点，下面将结合附图与具体实施例对本专利技术做进一步详细说明。
[0016]实施例1鱼类miRNA(pol
‑
miR
‑
n199
‑
3p)的获得
[0017]分别选取健康的和鳗弧菌感染的牙鲆(约50g/鱼)脾脏组织，使用Trizol法提取总RNA，并对RNA的浓度和纯度进行评估。选择RNA完整系数≥8.8的RNA，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)进一步富集长度在18
‑
30nt的RNA；将富集的RNA分别连接3
’
和5
’
接头；连接后的产物通过RT
‑
PCR实验进行反转录；选择长度在140
‑
160bp范围的扩增产物，按照Illumina平台标准流程构建miRNA cDNA转录组文库。利用Illumina HiSeq2500平台的SE50策略进行sRNA
‑
seq高通量测序。使用fastp(v0.12.4)软件对测序获得的原始数据进行质量过滤，去除如下数据：含有未知核苷酸“N”；不含有3
’
接头或未插入小RNA片段；污染了5
’
接头；含有poly(A)；长度小于18nt。获得过滤后的高质量数据后，利用Blastall(v2.2.25)软件，以identity＞97％为标准，与GeneBank数据库和Rfam数据库进行比对；同时，利用Bowtie(v1.1.2)软件与牙鲆参考基因(PRJNA369269)组进行比对，进而去除数据中的rRNA、scRNA、snoRNA、snRNA、tRNA等小RNA，以及比对到重复序列的小片段和mRNA降解产生的小片段。将剩余的数据与miRBase(release 21.0)数据库进行比对，鉴定已知的miRNA；同时，使用MIREAP(v0.2)软件，根据数据在基因组的位置和发夹结构预测牙鲆新的miRNA。
[0018]pol
‑
miR
‑
n199
‑
3p是新发现的牙鲆miRNA之一，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：5
’‑
caacacugguuuguaagcuggc
‑3’
。
[0019]实施例2牙鲆pol
‑
miR
‑
n199
‑
3p抗鳗弧菌感染实验
[0020]1、抗菌制剂的制备
[0021]根据实施例1中获得的碱基序列，通过Genepharma公司合成pol
‑
miR
‑
n199
‑
3p模拟物，同时合成阴性对照(negative control，NC)。利用无菌PBS溶解pol
‑
miR
‑
n199
‑
3p模拟物，制备抗菌制剂，浓度为20μM；同时制备NC对照溶液(20μM)。
[0022]2、制备鳗弧菌悬液(5
×
106CFU/mL)
[0023]制备方法参考Ning XH,Sun L.Gene network analysis reveals a core set of genes involved in the immune response of Japanese flounder(Paralichthys olivaceus)against Vibrio anguillarum infection.Fish Shellfish Immun.2020,98,800
‑
809.。
[0024]3、分组测试
[0025]将健康的牙鲆(市购，约50g/鱼)随机分成3组：即Ct组、NC组和miR组。采用肌肉注射方法，具体如下：
[0026]Ct组：每条鱼注射100μL的PB本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鱼类miRNA，其特征在于，所述鱼类为牙鲆，所述miRNA的名称为pol
‑
miR
‑
n199
‑
3p，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。2.权利要求1所述的鱼类miRNA在制备模拟物中的应用，其特征在于，所述模拟物的序列如SEQ ID NO.1所示。3.权利要求1所述的鱼类miRNA在制备抗菌制剂中的应用，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：宁先会，韩冰，彭冶，张凯，暨杰，尹绍武，
申请(专利权)人：南京师范大学，
类型：发明
国别省市：