一种用于鉴别六堡茶中近缘微生物的特异性核酸序列筛选方法技术

本发明专利技术公开了一种用于鉴别六堡茶中近缘微生物的特异性核酸序列筛选方法，该方法采用目标微生物及其近缘微生物的基因组序列文件进行比对，再经过在线NCBI数据库比对，进一步删除非特异序列后，得到特异蛋白序列集；并设计鉴别PCR引物，将得到备选引物集中引物通过扩增，根据扩增结果删除其中存在非特异扩增的引物；提取目标微生物及其近缘微生物的基因组DNA分别作为模板，进行PCR扩增，删除备选引物集中无法有效扩增的引物，删除备选引物集中存在非特异扩增的引物对。本发明专利技术的筛选方法采用多次生物信息学比对和虚拟筛选技术，减少了PCR等实验筛选过程所需资源，高效地获得大量目标微生物的特异性核酸序列，缩短特异性核酸序列筛选时间。序列筛选时间。序列筛选时间。

【技术实现步骤摘要】
一种用于鉴别六堡茶中近缘微生物的特异性核酸序列筛选方法


[0001]本专利技术属于微生物信息学
，更具体地，涉及一种用于鉴别六堡茶中近缘微生物的特异性核酸序列筛选方法。

技术介绍

[0002]六堡茶等黑茶品质的形成与微生物参与的发酵过程密不可分。六堡茶发酵过程中微生物的种类是影响六堡茶品质的重要因素。六堡茶加工过程中存在多种微生物，其中部分微生物为近缘微生物。近缘微生物的不同却影响六堡茶的感官品质。快速鉴定六堡茶中微生物的种类是六堡茶加工及品质控制中的关键技术要点。
[0003]5.8S rDNA与28S rDNA基因间隔序列(ITS)和16S rRNA全序列分析是目前真菌鉴定中用得较多的技术，一般可以鉴定到属水平，但是在近缘微生物物种水平鉴定中区分度不高。进行近缘微生物鉴定需要特异性更高的核酸序列，其中在近缘微生物物种水平上具有特异性的核酸序列是理想的鉴别近缘微生物的特异性核酸序列。对于六堡茶加工中近缘微生物的鉴定，一直是加工工艺研究中的一项重要工作。传统形态、生理生化特性为基础的鉴别方法具有培养时间长、近缘微生物形态接近、区分度不高等缺陷。
[0004]微生物分子生物学和生物信息学技术发展过程中，已经产生了大量的微生物基因组测序数据。这些数据通常是开放、便于获取的。已经发现微生物基因组中存在部分基因与其他进化谱系中的基因没有同源性或同源性很低的基因，这部分基因天然具有物种特异性高的特征，可以用于六堡茶加工中近缘微生物物种鉴定。
[0005]鉴于此，特提出本专利技术。
专利技术内容
[0006]针对现有技术所存在的不足，本专利技术提供了本专利技术提供一种用于鉴别六堡茶中近缘微生物的特异性核酸序列筛选方法，以解决现有技术在六堡茶中同一属下近缘微生物物种鉴定困难的问题。
[0007]为实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：
[0008]用于鉴别六堡茶中近缘微生物的特异性核酸序列筛选方法，
[0009]包括以下步骤：
[0010]1)获得六堡茶中目标微生物及其近缘微生物的基因组序列和预测蛋白序列；
[0011]2)使用1)中目标微生物及近缘微生物基因组蛋白序列文件建立本地Blast数据库；
[0012]3)采用BLASTp比对程序对目标微生物蛋白序列和步骤2)中近缘微生物蛋白序列数据库进行比对，目标微生物蛋白序列中经比，对后将未找到同源物的所有蛋白序列作为目标微生物蛋白序列筛选集Ⅰ；
[0013]4)将步骤3)得到的目标微生物蛋白序列筛选集Ⅰ用tBLASTn程序和近缘微生物基
因组序列进行比对，比对后将未找到同源物的所有蛋白序列作为目标微生物蛋白序列筛选集Ⅱ；
[0014]5)将步骤4)得到的目标微生物蛋白序列筛选集Ⅱ通过BLASTp在NCBI数据库中进行比对，比对后将未找到同源物的所有蛋白序列作为目标微生物蛋白序列筛选集Ⅲ；
[0015]6)将步骤5)得到的目标微生物蛋白序列筛选集Ⅲ在目标微生物基因组中查找对应的基因序列，形成基因序列集Ⅰ；
[0016]7)将步骤6)得到的基因序列集Ⅰ中基因序列用作PCR引物设计模板，按照PCR引物设计原则，设计相应序列的引物并命名，得到备选引物集Ⅰ及产物长度信息表Ⅰ；
[0017]8)采用目标微生物和近缘微生物的基因组序列分别构建本地Blast数据库；
[0018]9)将步骤7)得到的备选引物集Ⅰ及产物长度信息表Ⅰ在步骤8)得到近缘微生物数据库中进行e
‑
PCR，得到近缘微生物扩增信息表Ⅰ；
[0019]10)去除备选引物集Ⅰ中在目标微生物和近缘微生物基因组存在e
‑
PCR非特异扩增产物的引物对，得到备选引物集Ⅱ及产物长度信息表Ⅱ；
[0020]11)从六堡茶中分离、纯化、培养目标微生物及近缘微生物；
[0021]12)提取目标微生物和近缘微生物基因组DNA，构建近缘微生物混合核酸池；
[0022]13)分别以目标微生物基因组DNA和步骤12)获得的核酸池为模板，以步骤10)所得的备选引物集Ⅱ中的引物为扩增引物进行PCR，扩增产物进行检测；
[0023]14)将步骤13)中检测结果与产物长度信息表Ⅱ进行比对，目标微生物菌株扩增结果一致的引物筛选作为备选引物集Ⅲ；
[0024]15)将步骤13)中检测结果中目标微生物基因组为模板进行PCR扩增结果存在无法扩增或非特异扩增产物的引物对从步骤13)所得的备选引物集Ⅲ中删除，剩下的引物构成备选引物集IV；
[0025]16)将步骤13)中检测结果中近缘微生物基因组为模板进行PCR扩增结果存在扩增产物长度结果一致的引物对从步骤15)所得的备选引物集IV中删除，剩下的引物构成目标微生物鉴别引物集Ⅰ；
[0026]17)以步骤16)中获得的目标微生物鉴别引物集Ⅰ中的引物为引物，从需要鉴别的六堡茶中分离、培养待检测微生物，并提取待检测微生物的基因组DNA为扩增模板进行PCR扩增，扩增产物进行检测；若检测结果为阳性，且步骤12)核酸池为模板的PCR检测为阴性，即可判断待测微生物为目标微生物，从而实现其与近缘微生物的鉴别。
[0027]较佳地，
[0028]步骤13)中扩增产物进行检测通过琼脂糖电泳、qPCR或核酸探针技术检测。
[0029]本专利技术的另一个技术方案提出一种用于鉴定Aspergillus chevalieri菌株的引物，包括如下引物对：
[0030]AchID1F：TTCGGCGGTATAGACTTCGTAAGACA
[0031]AchID1R：GGTGACCAAGTAGTAGGCAGCATCT
[0032]AchID2F：CCTGTGAGGCTCTGGCGTAAGTATT
[0033]AchID2R：CTGCTCATCATCTTCCTGTCCACCA
[0034]AchID3F：AGATCGCTCCACGATTCTGCTCTG
[0035]AchID3R：TTGGTTGCCAGTCTGCTGATAGGAA
[0036]AchID4F：AACATGAACATCGACAGCCCACAAAG
[0037]AchID4R：GCATAGTCCTCCCGTCCAGTAAGC。
[0038]较佳地，所述用于鉴定Aspergillus chevalieri菌株的引物在鉴定Aspergillus chevalieri菌株中的应用。
[0039]本专利技术的另一个技术方案提出一种用于鉴定Aspergillus cristatus菌株的引物，包括如下引物对：
[0040]AcrID1F：CACCTGGAAGACCGACACCGAATC
[0041]AcrID1R：TCATTGGCGAGTGGAAGGACAACAA
[0042]AcrID2F：ATGTCTCCAACCTTGTCCAGCACTT
[0043]AcrID2R：TGATGTA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于鉴别六堡茶中近缘微生物的特异性核酸序列筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：1)获得六堡茶中目标微生物及其近缘微生物的基因组序列和预测蛋白序列；2)使用1)中目标微生物及近缘微生物基因组蛋白序列文件建立本地Blast数据库；3)采用BLASTp比对程序对目标微生物蛋白序列和步骤2)中近缘微生物蛋白序列数据库进行比对，目标微生物蛋白序列中经比对后，将未找到同源物的所有蛋白序列作为目标微生物蛋白序列筛选集Ⅰ；4)将步骤3)得到的目标微生物蛋白序列筛选集Ⅰ用tBLASTn程序和近缘微生物基因组序列进行比对，比对后将未找到同源物的所有蛋白序列作为目标微生物蛋白序列筛选集Ⅱ；5)将步骤4)得到的目标微生物蛋白序列筛选集Ⅱ通过BLASTp在NCBI数据库中进行比对，比对后将未找到同源物的所有蛋白序列作为目标微生物蛋白序列筛选集Ⅲ；6)将步骤5)得到的目标微生物蛋白序列筛选集Ⅲ在目标微生物基因组中查找对应的基因序列，形成基因序列集Ⅰ；7)将步骤6)得到的基因序列集Ⅰ中基因序列用作PCR引物设计模板，按照PCR引物设计原则，设计相应序列的引物并命名，得到备选引物集Ⅰ及产物长度信息表Ⅰ；8)采用目标微生物和近缘微生物的基因组序列分别构建本地Blast数据库；9)将步骤7)得到的备选引物集Ⅰ及产物长度信息表Ⅰ在步骤8)得到近缘微生物数据库中进行e
‑
PCR，得到近缘微生物扩增信息表Ⅰ；10)去除备选引物集Ⅰ中在目标微生物和近缘微生物基因组存在e
‑
PCR非特异扩增产物的引物对，得到备选引物集Ⅱ及产物长度信息表Ⅱ；11)从六堡茶中分离、纯化、培养目标微生物及近缘微生物；12)提取目标微生物和近缘微生物基因组DNA，构建近缘微生物混合核酸池；13)分别以目标微生物基因组DNA和步骤12)获得的核酸池为模板，以步骤10)所得的备选引物集Ⅱ中的引物为扩增引物进行PCR，扩增产物进行检测；14)将步骤13)中检测结果与产物长度信息表Ⅱ进行比对，目标微生物菌株扩增结果一致的引物筛选作为备选引物集Ⅲ；15)将步骤13)中检测结果中目标微生物基因组为模板进行PCR扩增结果存在无法扩增或非特异扩增产物的引物对从步骤13)所得的备选引物集Ⅲ中删除，剩下的引物构成备选引物集IV；16)将步骤13)中检测结果中近缘微生物基因组为模板进行PCR扩增结果存在扩增产物长度结果一致的引物对从步骤15)所得的...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄建安，王仲，金琦芳，李勤，欧行畅，李适，刘仲华，
申请(专利权)人：湖南农业大学，
类型：发明
国别省市：