一种用于宫颈上皮内瘤变组织的消化酶组合物、消化液及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种用于宫颈上皮内瘤变(Squamous Intraepithelial Lesion，SIL)组织的消化酶组合物、消化液及其应用，涉及组织工程技术领域，所述消化液由以下组分组成：胶原酶I 0.2～20mg/mL，中性蛋白酶II 0.2～20mg/mL，脱氧核糖核酸酶I 20～2000μg/mL，DMEM/f12培养基，Y

【技术实现步骤摘要】
一种用于宫颈上皮内瘤变组织的消化酶组合物、消化液及其应用


[0001]本专利技术涉及组织工程
，具体涉及一种用于宫颈上皮内瘤变(Squamous Intraepithelial Lesion，SIL)组织的消化酶组合物、消化液及其应用。

技术介绍

[0002]宫颈癌是全球女性第四大常见恶性肿瘤，2020年全世界约有60.4万新病例，34.2万死亡病例，在我国目前每年有约11万例新发女性患者，5.9万死亡病例，死亡病例数据有逐年上升的趋势，广大妇女的健康和生命受到了严重威胁。宫颈癌的主要诱因是宫颈上皮细胞内高危型人乳头瘤病毒(human papilloma virus，HPV)的持续感染。从HPV感染到宫颈上皮内瘤变(Squamous Intraepithelial Lesion，SIL)再到宫颈癌发生，历经5至10年时间，这一病变过程为临床提供了绝佳的“诊治窗，逆转窗”。
[0003]目前研究中常用的宫颈癌细胞系(如Hela、Siha等)及宫颈上皮内瘤变细胞系(如S12、Ect1/E6E7)等，均处于整合状态，难以反映HPV感染初期的细胞状况。肿瘤细胞系细胞传代后表型和遗传信息较亲代差异较大，其遗传信息仅包含少部分的肿瘤遗传信息，缺乏广泛代表性及异质性，临床预测能力较差。刚离体的原代细胞保留有原有的生物学遗传特性，能反映体内细胞生长的一般特征，因此适用于疾病机制、药物及癌症治疗等研究。建立携带HPV的宫颈上皮细胞的体外细胞模型，有利于更好地了解HPV感染宫颈上皮细胞的病理改变。但由于SIL组织较为坚硬、纤维组织较多的特性，目前对SIL细胞的体外培养尚不成熟。
[0004]宫颈上皮细胞的分离一般采用胰蛋白酶消化，具体方法为：取新鲜人宫颈上皮组织，用PBS冲洗干净后，用剪刀镊子剔去脂肪等多余组织，将所得组织充分剪碎至1mm3大小，加入0.25％胰蛋白酶消化获得细胞。也有从人宫颈上皮组织中分离细胞后再采取胶原酶消化组织块的方法等。但上述方法存在细胞收获率低或者细胞活力低的问题。因此，提供一种细胞收获率高、细胞活力高的宫颈上皮内瘤变组织细胞的分离培养方法具有重要的现实意义。鉴于此，本专利技术提供一种用于宫颈上皮内瘤变组织的消化酶组合物及、消化液的配伍及其使用说明。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题是提供一种用于宫颈上皮内瘤变组织的消化酶组合物、消化液及其应用。目的是能够高效地从宫颈上皮内瘤变组织块中分离细胞，减少对细胞的损伤，从而使细胞活率高，较强的增殖能力，提高细胞收获量及细胞的分离效率。
[0006]本专利技术为了解决上述技术问题，第一个目的是提供一种用于宫颈上皮内瘤变组织的消化酶组合物，其包括胶原酶I，中性蛋白酶II和脱氧核糖核酸酶I，所述胶原酶I，所述中性蛋白酶II和所述脱氧核糖核酸酶I的质量比为(0.1～10)：(0.1～10)：(0.01～1)。
[0007]本专利技术的有益效果是：本专利技术使用胶原酶I、中性蛋白酶II和脱氧核糖核酸酶I联
合消化宫颈上皮内瘤变组织，三种消化酶组合物产生了协同增效作用，提高了细胞的收获量及活率，减少了对细胞的损伤，提高了增殖速率。
[0008]在上述技术方案的基础上，本专利技术还可以做如下改进。
[0009]进一步，所述胶原酶I，所述中性蛋白酶II和所述脱氧核糖核酸酶I的质量比为10：10：1。
[0010]第二个目的是提供一种用于宫颈上皮内瘤变组织的消化液，所述消化液由上述所述的用于宫颈上皮内瘤变组织的消化酶组合物、DMEM/f12培养基、Y
‑
27632和青霉素
‑
链霉素
‑
两性霉素B混合溶液组成，各组分的含量如下：胶原酶I 0.2～20mg/mL，中性蛋白酶II 0.2～20mg/mL，脱氧核糖核酸酶I 20～2000μg/mL，DMEM/f12培养基，Y
‑
27632 1～100μmol/L，0.1～10X青霉素
‑
链霉素
‑
两性霉素B混合溶液。
[0011]“X”代表的是稀释的倍数，例如将2X就是将原有的浓度稀释2倍。采用上述方案的有益效果是：本专利技术消化液的DMEM/f12培养基中的钙、镁、锌离子可激活胶原酶I、中性蛋白酶II，青霉素
‑
链霉素
‑
两性霉素B混合溶液可以减少后续培养过程中污染几率的作用，Y
‑
27632可显著减少分离细胞所诱导的凋亡，提高细胞存活效率，提高细胞增殖活率(从～1％提高到～27％)。
[0012]进一步，各组分的含量如下：胶原酶I 0.2～10mg/mL，中性蛋白酶II 0.2～10mg/mL，脱氧核糖核酸酶I 20～1000μg/mL，DMEM/f12培养基，Y
‑
27632 2～50μmol/L，0.2～5X青霉素
‑
链霉素
‑
两性霉素B混合溶液。
[0013]进一步，各组分的含量如下：各组分的含量如下：胶原酶I 0.5～4mg/mL，中性蛋白酶II 0.5～4mg/mL，脱氧核糖核酸酶I 50～400μg/mL，DMEM/f12培养基，Y
‑
27632 5～20μmol/L，0.5～2X青霉素
‑
链霉素
‑
两性霉素B混合溶液。
[0014]进一步，各组分的含量如下：胶原酶I 2mg/mL，中性蛋白酶II 2mg/mL，脱氧核糖核酸酶I 200μg/mL，DMEM/f12培养基，Y
‑
27632 10μmol/L，1X青霉素
‑
链霉素
‑
两性霉素B混合溶液。
[0015]第三个目的是提供一种宫颈上皮内瘤变组织细胞的分离方法，包括如下步骤：
[0016]步骤1，样品采集：采集活检宫颈上皮内瘤变组织或手术室宫颈上皮内瘤变组织标本，依次进行洗涤、去除脂肪组织及剪碎得到组织碎块；
[0017]步骤2，消化分离：将所述组织碎块与上述任一项所述消化液进行混合，所述组织碎块与所述消化液的质量体积比为1:10g/mL，混合均匀后在振荡下进行消化分离培养，所述消化分离培养的温度为36～38℃，时间为40～100min，直至所述组织碎块的纤维完全分散后终止所述消化分离培养。
[0018]本专利技术的有益效果如下：本专利技术提供了一种宫颈上皮内瘤变组织细胞的分离方法，消化液中加入Y
‑
27632，可以有效提高细胞活性、促进细胞生长，从而获得优质的原代细胞，采用本专利技术的特制的消化液配比可以在最大程度上离散宫颈纤维组织，获得宫颈上皮细胞内瘤变原代细胞；可以显著提高宫颈上皮细胞的活性和增殖速率，从而为相关研究项目提供优质的实验材料。
[0019]进一步，步骤1中的样品采集的具体过程为：先将采集的活检宫颈上皮内瘤变组织或手术室宫颈上皮内瘤变组织标本，放置于含有3～8wt％胎牛血清和1X～3X青霉素
‑
链霉本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于宫颈上皮内瘤变组织的消化酶组合物，其特征在于，其包括胶原酶I，中性蛋白酶II和脱氧核糖核酸酶I，所述胶原酶I，所述中性蛋白酶II和所述脱氧核糖核酸酶I的质量比为(0.1～10)：(0.1～10)：(0.01～1)。2.根据权利要求1所述一种用于宫颈上皮内瘤变组织的消化酶组合物，其特征在于，所述胶原酶I，所述中性蛋白酶II和所述脱氧核糖核酸酶I的质量比为10：10：1。3.一种用于宫颈上皮内瘤变组织的消化液，其特征在于，所述消化液由权利要求1或2所述的用于宫颈上皮内瘤变组织的消化酶组合物、DMEM/f12培养基、Y
‑
27632和青霉素
‑
链霉素
‑
两性霉素B混合溶液组成，各组分的含量如下：胶原酶I 0.2～20mg/mL，中性蛋白酶II 0.2～20mg/mL，脱氧核糖核酸酶I 20～2000μg/mL，DMEM/f12培养基，Y
‑
27632 1～100μmol/L，0.1～10X青霉素
‑
链霉素
‑
两性霉素B混合溶液。4.根据权利要求3所述的一种用于宫颈上皮内瘤变组织的消化液，其特征在于，各组分的含量如下：胶原酶I 0.2～10mg/mL，中性蛋白酶II 0.2～10mg/mL，脱氧核糖核酸酶I 20～1000μg/mL，DMEM/f12培养基，Y
‑
27632 2～50μmol/L，0.2～5X青霉素
‑
链霉素
‑
两性霉素B混合溶液。5.根据权利要求3所述一种用于宫颈上皮内瘤变组织的消化液，其特征在于，各组分的含量如下：各组分的含量如下：胶原酶I 0.5～4mg/mL，中性蛋白酶II 0.5～4mg/mL，脱氧核糖核酸酶I 50～400μg/mL，DMEM/f12培养基，Y
‑
27632 5～20μmol/L，0.5～2X青霉素
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：马丁，廖书杰，胡柏，王仁杰，阮靖函，吴迪，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属同济医院，
类型：发明
国别省市：