用于检测HER-2基因的引物探针组合及试剂盒和用途制造技术

本发明专利技术属于涉及生物技术领域，公开了用于检测HER

【技术实现步骤摘要】
用于检测HER
‑
2基因的引物探针组合及试剂盒和用途


[0001]本专利技术涉及生物
，特别是涉及用于检测HER
‑
2基因的引物探针组合及试剂盒和用途。

技术介绍

[0002]微滴式数字PCR是一种新型的绝对定量PCR技术，其原理是将含有核酸的PCR反应体系分成几万个的微滴，每个微滴含有一个或数个待检核酸靶分子，有的则不含待检核酸。这些小微滴同时进行PCR反应后，利用微滴分析仪对每个微滴进行逐个检测，最终根据泊松分布原理以及阳性和阴性微滴的比例，计算出原来的反应液当中有多少个目标基因的拷贝。目前，各种分子检测方法日新月异，而微滴式数字PCR因其具有操作便捷、准确灵敏、耗时较短、标本兼容、解读简单、通量可塑、阈值客观、成本较低等优点，该技术在基因拷贝数变异、基因突变检测、病原体检测和基因表达分析等临床研究领域有着重要的应用。
[0003]HER
‑
2也称为c
‑
erB
‑
2。人类HER
‑
2基因定位于染色体17q21，为原癌基因，其编码的HER
‑
2蛋白是表皮生长因子受EGFRs家族中的一员，由胞外的配体结合区、单链跨膜区及胞内的蛋白酪氨酸激酶区三部分组成，具有酪氨酸蛋白激酶活性。当细胞外相应片段与HER
‑
2结合后通过引起受体二聚化及胞浆内酪氨酸激酶区的自身磷酸化激活细胞内酪氨酸激酶，从而活化细胞内信息传递途径通路，如Ras/Raf/MAPK、PI3K/Akt、STAT等通路。
[0004]HER
‑
2蛋白主要在胚胎发育时开始表达，成年以后在正常组织内低水平表达。研究表明，约30％肿瘤中存在HER
‑
2基因的扩增/蛋白过度表达，如乳腺癌、胃癌、子宫内膜癌、卵巢癌、食管癌和前列腺癌等。HER
‑
2过表达与抑制凋亡、促增殖、增强肿瘤转移潜能相关联。过表达的HER
‑
2蛋白会通过诱导血管内皮生长因子，促肿瘤血管形成，加速肿瘤细胞的分裂和增殖，抑制其凋亡，最终促进肿瘤的生长和转移。
[0005]HER
‑
2基因在临床中具有重要的应用价值，除了作为预后指标，是多种恶性肿瘤包括乳腺癌、胃癌、结直肠癌等重要的预测性分子标志物，通过HER
‑
2基因的状态可以筛选出适合抗HER
‑
2分子靶向治疗的病人。目前应用于临床的抗HER2靶向药物包括3大类：单克隆抗体(曲妥珠单抗、帕妥珠单抗)、酪氨酸激酶抑制剂(TKI)和抗体偶联药物(ADC)。抗HER2治疗最先取得成功的领域是伴有HER2扩增肿瘤。例如乳腺癌和胃癌，约30％的乳腺癌、10
‑
20％的胃癌可出现HER2基因扩增，这些患者传统治疗效果不佳，预后较差，但可以从抗HER
‑
2分子靶向治疗中明确获益。除了乳腺癌和胃癌之外，抗HER2的治疗也已经应用到了其他实体瘤，包括结直肠癌、膀胱癌等。除了HER2扩增以外，随着近年来ADC类药物的出现，抗HER2治疗的适用范围已经从HER2扩增/过表达延伸到HER2低表达领域。由此可见，正确检测和评定HER
‑
2基因状态对于筛选合适的患者、确定合理的治疗方案至关重要。
[0006]临床工作中，HER
‑
2基因的常规检测方法是免疫组织化学(IHC)和荧光原位杂交技术(FISH)。免疫组化方法根据HER
‑
2蛋白表达的强度进行评分，在不同的瘤种有不同的评分标准，基本上是根据染色的强度和范围分为0、1+、2+、3+四个等级。荧光原位杂交技术是目前检测HER2基因扩增的金标准，通过荧光标记的探针与细胞核内的靶序列杂交，在荧光显
微镜下，在组织原位观察并计数细胞核内荧光信号，从而获得靶基因状态相关的信息。免疫组织化学简便，应用范围最为广泛，但判读具有很强主观性，不同医师之间判读结果可能不同。荧光原位杂交方法虽可以根据荧光信号计算基因拷贝数，但当HER
‑
2基因为簇状扩增时，医师则会无法准确计数，通常估算为15
‑
30拷贝数。此外，此两种方法共有的局限性为所检测的标本类型必须为组织切片或细胞涂片，不能检测液相标本，这就限制了其临床应用的场景。近年来越来越广泛应用的高通量测序技术(NGS)则需要复杂的设备和数据算法，对样本质量要求高，实验周期长，成本高，但在检测基因拷贝数变化方面，NGS技术并没有显示出优势。

技术实现思路

[0007]鉴于以上所述现有技术的缺点，本专利技术的目的在于提供用于检测HER
‑
2基因的引物探针组合及试剂盒和用途，以期解决现有技术中存在的问题。
[0008]为实现上述目的，本专利技术具体采用如下技术方案。
[0009]本专利技术的第一方面保护用于检测HER
‑
2基因的引物探针组合，所述引物探针组合包括HER
‑
2引物和HER
‑
2探针，所述HER
‑
2引物包括序列如SEQ ID NO.1所示和SEQ ID NO.2所示的引物；所述HER
‑
2探针包括序列如SEQ ID NO.3所示的探针。
[0010]优选地，所述HER
‑
2探针的一端修饰有荧光报告基因，所述HER
‑
2探针的另一端修饰有淬灭基团。
[0011]更优选地，所述荧光报告基团选自FAM、VIC、HEX、TET、JOE、CY3和CY5中的一种或多种。
[0012]更优选地，所述淬灭基团包括NFQ、MGB、BHQ1、BHQ2和BHQ3中的一种或多种。
[0013]更优选地，所述HER
‑
2探针的5
’
端标记荧光报告基团，3
’
端标记淬灭基团。
[0014]进一步优选地，所述HER
‑
2探针的5
’
端标记荧光报告基团FAM，3
’
端标记淬灭基团NFQ和MGB。
[0015]在某些实施方式中，所述引物探针组合还包括内参基因引物和内参基因探针中的一种或两种。
[0016]优选地，所述内参基因为EFTUD2基因。
[0017]优选地，所述内参基因引物包括序列如SEQ ID NO.4所示和SEQ ID NO.5所示的引物。
[0018]优选地，所述内参基因探针包括序列如SEQ ID NO.6所示的探针。
[0019]优选地，所述内参基因探针的一端修饰有荧光报告基因，所述内参基因探针的另一端修饰有淬灭基团。
[0020]更优选地，所述荧光报告基团选自FAM、VIC、HEX、TET、JOE、CY3和CY5中的一种或多种。
[0021]更优选地，所述淬灭基团包括NFQ、MGB、BHQ1、BHQ2和BHQ3的一种或多种。
[002本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于检测HER
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2基因的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合包括HER
‑
2引物和HER
‑
2探针，所述HER
‑
2引物包括序列如SEQ ID NO.1所示和SEQ IDNO.2所示的引物；所述HER
‑
2探针包括序列如SEQ ID NO.3所示的探针。2.如权利要求1所述的引物探针组合，其特征在于，所述引物探针组合还包括内参基因引物和内参基因探针中的一种或两种；优选地，所述内参基因为EFTUD2基因。3.如权利要求2所述的引物探针组合，其特征在于，所述内参基因引物包括序列如SEQID NO.4所示和SEQ ID NO.5所示的引物；和/或，所述内参基因探针包括序列如SEQ ID NO.6所示的探针。4.如权利要求3所述的引物探针组合，其特征在于，所述HER
‑
2探针和所述内参基因探针的一端均修饰有荧光报告基团，所述HER
‑
2探针和所述内参基因探针的另一端均修饰有淬灭基团；优选地，所述荧光报告基团选自FAM、VIC、HEX、TET、JOE、CY3和CY5中的一种或多种；优选地，所述淬灭基团包括NFQ、MGB、BHQ1、BHQ2和BHQ3中的一种或多种；优选地，所述HER
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2探针的荧光报告基因与所述内参基因探针的荧光报告基因不同。5.一种检测HER
‑
2基因的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1
‑
4任一项所述的引物探针组合。6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯英勇，徐晨，黄洁，蒋冬先，刘玉凤，黄雯，栾丽娟，王祥，于子翔，宋琦，潘伟瑜，邓民英，刘佳，宿杰阿克苏，
申请(专利权)人：复旦大学附属中山医院，
类型：发明
国别省市：