一种磁性纳米复合颗粒及其制备方法与在癌症标志物检测中的应用技术

本发明专利技术公开了一种磁性纳米复合颗粒及其制备方法与在癌症标志物检测中的应用，属于生物分子检测技术领域；本发明专利技术首先将纳米粒子(Ag NPs)以Ag

【技术实现步骤摘要】
一种磁性纳米复合颗粒及其制备方法与在癌症标志物检测中的应用


[0001]本专利技术属于生物分子检测
，具体涉及一种磁性纳米复合颗粒及其制备方法与在癌症标志物检测中的应用。

技术介绍

[0002]作为一种人体组织中重要的同功酶，碱性磷酸酶的主要功能为水解各种单磷酸酯，释放无机磷酸盐，在磷代谢中发挥着重要作用。在人体中，碱性磷酸酶参与了各种重要的生命活动过程，如钙磷代谢、细胞内通讯和骨矿化。已有研究表明ALP活性异常通常与癌症有关，例如结肠癌，肺癌，肝癌，乳腺癌，胰腺癌，卵巢癌和前列腺癌相关，以及与人类骨科疾病(成骨细胞瘤、畸形骨炎和佝偻病)、肝病(肝炎和梗阻性黄疸)、糖尿病和心力衰竭也有密切联系，在临床诊断和生物医学研究中发挥着重要作用。作为一种人体组织中重要的同功酶，碱性磷酸酶的主要功能为水解各种单磷酸醋，释放无机磷酸盐，在磷代谢中发挥着重要作用。在人体中，碱性磷酸酶参与了各种重要的生命活动过程，如钙磷代谢、细胞内通讯和骨矿化。鉴于血清ALP水平对相关疾病的临床诊断具有重要意义，因此，构建高灵敏度、高选择性的检测血清ALP水平的方法具有重要价值。
[0003]目前，用于ALP活性检测的方法之一是利用碱性磷酸酶对底物L
‑
抗坏血酸
‑2‑
磷酸三钠盐(AAP)的去磷酸化过程，产生具有强还原性的水解产物抗坏血酸(AA)，通过利用AA的还原性进行还原具有强氧化性的物质，通过一些检测技术如荧光、拉曼等技术进行检测还原产物对某种反应的影响，从而提供相关的光谱信号和碱性磷酸酶活性之间的计量关系。利用这一特性，人们开发了大量的生化传感器实现了对AA的氧化产物进行分析和检测。但该利用AA的还原性进行还原具有氧化性的物质的方法存在一定的局限性，一方面在复杂的生物反应体系当中，具有强氧化性的物质本身易受到溶液其他同样具有强还原性的物质的干扰，易造成其非特异性还原反应，进而导致实验结果存在假阳性结果的情况，结果的可靠性得不到保证；另一方面，AA具有化学性质活泼，在复杂的溶液环境当中，容易与其他具有氧化性物质进行氧化还原反应，也同样在检测过程中易造成其非特异性氧化反应，进而导致假阴性结果的发生。
[0004]根据AA的结构式分析可知，其具有顺二羟基的结构式，而顺二羟基在碱性的条件下可以与苯硼酸基团高选择性的形成五元环状苯硼酸酯，从而可以将苯硼酸功能化的光谱信号分子进行接枝在表面，从而提供相关的光谱信号和碱性磷酸酶活性之间的计量关系。但从AA的结构上进行合成反应的这一检测途径被用于开发针对碱性磷酸酶的生物化学传感器的报道相对较少，并且在该类生物化学传感器中引入磁性材料，达到反应后快速分离，减少溶液环境的干扰的效果的报道也较少出现。
[0005]与此同时，不同实际生物样品中环境十分复杂，存在各种的综合性的影响，各种单磷酸酯在参与ALP的去磷酸化作用的时候，有必要对各种单磷酸酯从复杂样品中进行富集后分离出来，而将非磁性的反应底物难以使用离心过程进行很好的区分并达到富集的效
果，从而对实验结果造成了很大的影响。
[0006]因此，创建一种特异性强、灵敏度高、结果可靠并易于富集和快速分离的检测传感器用于碱性磷酸酶活性分析对于临床疾病诊断和碱性磷酸酶生物学研究具有重要意义。
[0007]公开号为CN113295672A的专利技术提供了一种基于表面增强拉曼光谱技术定量检测海水中碱性磷酸酶的方法，以BCIP为底物，DMSO为内标物，证实ALP活性和特征峰与内标峰强度比值(600cm1/677cm1)之间具有良好的线性关系，相关系数为0.977，利用该模型定量检测海水样品中ALP活性，但是酸性物质的存在会导致DMSO在较低温度下分解，生成低沸点产物如二甲基硫化物、甲基硫醇、二甲基二硫化物等进而对检测造成干扰，因此此方法只适用于碱性环境中；公开号为CN103969436A的专利技术公开了一种超灵敏碱性磷酸酶检测的新方法，使待测样品中的碱性磷酸酶水解5
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溴
‑4‑
氯
‑3‑
吲哚磷酸，生成5
‑
溴
‑4‑
氯
‑3‑
吲哚和无机磷酸盐，5
‑
溴
‑4‑
氯
‑3‑
吲哚还原尼罗蓝A，降低尼罗蓝A的SERS强度，从而间接检测碱性磷酸酶，此方法侧重提升碱性磷酸酶检测技术的灵敏度，但当其他物质与碱性磷酸酶共存时，如何克服其他物质干扰的技术问题尚未解决。

技术实现思路

[0008]本专利技术公开了一种磁性纳米复合颗粒及其制备方法与在癌症标志物检测中的应用，利用TiO2富集磷酸酯的作用力，将Ag
‑4‑
MPBA
‑
AAP NPs接枝在Fe3O4@Au@TiO
2 NPs表面,形成磁性纳米复合颗粒Fe3O4@Au@TiO2‑
(AAP
‑4‑
MPBA
‑
Ag)NPs，在ALP作用下，磁性纳米复合颗粒Fe3O4@Au@TiO2‑
[0009](AAP
‑4‑
MPBA
‑
Ag)NPs获得相应的拉曼信号，根据拉曼光谱信号与ALP活性之间的计量关系从而测得ALP的活性和含量。
[0010]本专利技术的技术方案如下：
[0011]本专利技术的目的之一在于提供一种磁性纳米复合颗粒的制备方法，首先将纳米粒子Ag NPs以Ag
‑
S键接枝4
‑
巯基苯硼酸形成五元苯硼酸酯，通过五元苯硼酸酯接枝AAP形成中间介体Ag
‑4‑
MPBA
‑
AAP NPs，然后利用TiO2富集磷酸酯的作用力，将Ag
‑4‑
MPBA
‑
AAP NPs接枝在Fe3O4@Au@TiO
2 NPs表面，形成磁性纳米复合颗粒Fe3O4@Au@TiO2‑
(AAP
‑4‑
MPBA
‑
Ag)NPs。
[0012]进一步的，具体包括以下步骤：
[0013]S1、Fe3O4@Au@TiO
2 NPs的制备：通过自主组装的方法将所制备的Au Seed NPs加入氨基化的Fe3O
4 NPs当中进行不饱和吸附，得到Fe3O4@Au seed NPs，然后将通过种子生长法制得的Fe3O4@Au NPs与乙醇乙腈混合物、TBOT以及氨水反应，制备得到Fe3O4@Au@TiO
2 NPs；
[0014]S2、Ag
‑4‑
MPBA
‑
AAP NPs的制备：取用AgNO3与柠檬酸钠制备Ag NPs溶液，然后在溶液中先后加入4
‑
MPBA、AAP与之反应得到Ag
‑4‑
MPBA
‑
AAP NPs；
[0015]S3、Fe3O4@Au@TiO2‑
(AAP
‑4‑
MPBA
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种磁性纳米复合颗粒的制备方法，其特征在于，首先将纳米粒子Ag NPs以Ag
‑
S键接枝4
‑
巯基苯硼酸形成五元苯硼酸酯，通过五元苯硼酸酯接枝AAP形成中间介体Ag
‑4‑
MPBA
‑
AAP NPs，然后利用TiO2富集磷酸酯的作用力，将Ag
‑4‑
MPBA
‑
AAP NPs接枝在Fe3O4@Au@TiO
2 NPs表面，形成磁性纳米复合颗粒Fe3O4@Au@TiO2‑
(AAP
‑4‑
MPBA
‑
Ag)NPs。2.如权利要求1所述的一种磁性纳米复合颗粒的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤：S1、Fe3O4@Au@TiO
2 NPs的制备：通过自主组装的方法将所制备的Au Seed NPs加入氨基化的Fe3O
4 NPs当中进行不饱和吸附，得到Fe3O4@Au seed NPs，然后将通过种子生长法制得的Fe3O4@Au NPs与乙醇乙腈混合物、TBOT以及氨水反应，制备得到Fe3O4@Au@TiO
2 NPs；S2、Ag
‑4‑
MPBA
‑
AAP NPs的制备：取用AgNO3与柠檬酸钠制备Ag NPs溶液，然后在溶液中先后加入4
‑
MPBA、AAP与之反应得到Ag
‑4‑
MPBA
‑
AAP NPs；S3、Fe3O4@Au@TiO2‑
(AAP
‑4‑
MPBA
‑
Ag)NPs的制备：超声均匀分散的Fe3O4@Au@TiO
2 NPs，加入上述步骤制备得到的Ag
‑4‑
MPBA
‑
AAP NPs，摇匀后在摇床中常温下反应30
‑
40h，磁选和洗涤多次后进行重悬，其中Fe3O4@Au@TiO
2 NPs与Ag
‑4‑
MPBA
‑
AAP NPs的体积比为1:5。3.如权利要求2所述的一种磁性纳米复合颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中Fe3O4@Au@TiO
2 NPs的制备具体包括如下步骤：S11、将1.3
‑
1.4g FeCl
3 6H2O溶解于乙二醇中搅拌均匀，在加热条件下将无水醋酸钠和PEG共同搅拌至溶解，将两种混合溶液转至高压釜反应，冷却后分别使用乙醇和去离子水进行洗涤并干燥，得到Fe3O
4 NPs；S12、将浓度为0.01wt％的HAuCl4和浓度为1wt％的柠檬酸钠混合，加入NaBH4，常温搅拌得到Au seed NPs；S13、在Fe3O
4 NPs中加入聚乙烯亚胺，溶解于无水乙醇中超声混合均匀，得到氨基化Fe3O
4 NPs，使用去离子水洗涤，通过自主组装的方法将Au Seed NPs加入氨基化的Fe3O
4 NPs当中进行不饱和吸附，超声后使用去离子水磁选洗涤，重悬总溶液得到Fe3O4@Au seed NPs；S14、利用种子生长法，将Fe3O4@Au seed NPs溶液与包含PVP和盐酸羟胺的去离子水进行超声，而后加入HAuCl4再次超声制得Fe3O4@Au NPs，使用去离子水洗涤备用；S15、将所得颗粒Fe3O4@Au NPs分散于含有氨水的乙醇乙腈混合A液，然后在冰水浴搅拌下加入含有TBOT的乙醇乙腈混合B液，并在室温下进行超声、磁选、洗涤和干燥，得到Fe3O4@Au@TiO
2 NPs。4.如权利要求2所述的一种磁性纳米复合颗粒的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中Ag
‑4‑
MPBA
‑
AAP NPs的制备具体包括如下步骤：S21、取用AgNO3加入去离子水，加热沸腾之后加入浓度为1wt％柠檬酸钠，去离子水与柠檬酸钠的体积比为20:1，持续反应1h制得原溶液Ag NPs溶液，静置冷却至室温；S22、取用0.5mL S21中的原溶液Ag NPs溶液，稀释10倍后加入5mL去离子水混合均匀，然后加入290
‑
300μL浓度为10
‑4M的4
‑
MPBA反应0.5
‑
1.5h，反应后离心并重悬5mL,得到Ag
‑4‑
MPBA NPs；S23、将S22所制得的Ag
‑4‑
MPBA NPs溶液加入0.05
‑
0.15g AAP混合均匀，反应1h后离心并重悬5mL，得到Ag
‑4‑
MPBA
‑
AAP NPs。
5.如权利要求3所述的一种磁性纳米复合颗粒的制备方法，其特征在于，所述S11中无水醋酸钠和PEG的搅拌溶解温度为50

【专利技术属性】
技术研发人员：列健森，卢玉栋，游瑞云，陈静波，吴阳，沈慧英，朱兰瑾，刘云珍，
申请(专利权)人：福建师范大学，
类型：发明
国别省市：