一种海洋链霉菌S187中小蛋白预测和鉴定方法技术

本发明专利技术提供了一种海洋链霉菌S187中小蛋白预测和鉴定方法，其包括以下步骤：1)全面数据库的建立：对于非模式菌株定制包含基因组预测与转录组检测的数据库；2)样品处理：提取不同代谢时间点的样品中的多肽并进行富集，然后将富集到的微肽进行高精密度DIA质谱检测；3)SEP鉴定结果分析：通过质谱数据分析得到样品微肽的定性与定量结果，并将质谱数据同时采用数据库搜索与不依赖于数据库的de novo测序的鉴定方法寻找新颖的多肽与ncRNA。本发明专利技术有助于在多肽测序中测到氨基酸长度更长的多肽和提高蛋白对应多肽的覆盖率，为后续分析提供更可靠的肽段定位和定量信息。可靠的肽段定位和定量信息。可靠的肽段定位和定量信息。

【技术实现步骤摘要】
一种海洋链霉菌S187中小蛋白预测和鉴定方法


[0001]本专利技术涉及细菌中微肽的鉴定
，具体而言，涉及一种海洋链霉菌S187中小蛋白预测和鉴定方法。

技术介绍

[0002]小开放阅读框(Small open reading frames,smORFs)是真核生物和细菌中可以从少于100个密码子翻译出来的DNA序列。它们广泛分布在各种物种的基因组中，并且越来越多的研究表明它们具有重要功能。然而，smORF通常根据其小大或者特殊结构被认为是非编码的而常常被人们忽视。
[0003]近年来，随着新一代测序(NGS)技术的进步，人们开发了各种基于生物信息学的方法来探索数以千计的smORF。质谱(MS)是直接测定和定量编码多肽(smORF encoded polypeptides，SEPs)最通用的工具。然而质谱法鉴定SEPs仍然存在一些缺点如由于SEPs通常都表达量较低且分子量都比较小，在质谱的检测的过程中高表达量的大蛋白的肽段信号干扰而造成SEPs的漏检，因此需要针对于SEPs的特异性富集与高精密的检测方法以提高SEPs的鉴定准确性与本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种海洋链霉菌S187中小蛋白预测和鉴定方法，其特征在于，其包括以下步骤：1)全面数据库的建立：对于非模式菌株定制包含基因组预测与转录组检测的数据库；2)样品处理：提取不同代谢时间点的样品中的多肽并进行富集，然后将富集到的微肽进行高精密度DIA质谱检测；3)SEP鉴定结果分析：通过质谱数据分析得到样品微肽的定性与定量结果，并将质谱数据同时采用数据库搜索与不依赖于数据库的de novo测序的鉴定方法寻找新颖的多肽与ncRNA。2.根据权利要求1所述的海洋链霉菌S187中小蛋白预测和鉴定方法，其特征在于，步骤1)包括以下过程：1.1)全基因组预测：选取两种软件对S187全基因组ORF进行预测：将S187全基因组fasta序列提交到ORFFinder进行六帧翻译，使用ATG、GTG、CTG、TTG四种起始密码子，并选择代表细菌的11号密码子翻译表进行翻译；使用Prodigal软件进行全基因组ORF预测作为ORFFinder工具的补充，并由此得到ORF对应的核糖体结合基序；运行参数选择代表细菌的11号密码子表，得到S187全基因组编码序列；对这些氨基酸序列长度进行统计，并筛选长度为100aa以下的ORFs作为smORFs；1.2)共线性分析：选取链霉菌属模式菌株天蓝色链霉菌作为参考，使用TBtools软件中的MCScanX工具与S187进行了基因组共线性分析以探究两菌株的相似关系；1.3)培养、取样：将星海链霉菌S187保藏菌株划线活化于TSB固体培养基，置于恒温培养箱，将活化后的菌种制备发酵种子液；取样：先进行S187的发酵曲线和抗补体活性曲线等测定菌株活动周期，根据发酵曲线和抗补体活性曲线确定取样时间点：为36h、48h、72h、120h，然后取样、洗脱、保藏；1.4)转录组测序建库：将4个时间点的样品合并进行RNA
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seq建库，具体步骤如下：样品经过RNA抽提、纯化、建库之后，采用NGS测序技术基于Illumina HiSeq测序平台，对这些文库进行PAIRED双末端测序；对转录组测序得到的全部的转录本使用NCBI ORFFinder进行开放阅读框搜索，最小ORF长度设置为30，Genetic code设置为11.Bacterial，ORF起始密码子选择为任意起始密码子；将得到的转录组六帧翻译数据作为Database，并在多肽组测序流程中进行搜库；转录组数据smRNAs预测：对转录组测序数据使用FastaQC、Trimmomatic进行质控，使用Bowtie2和featureCounts分别进行reads比对定量，并对FPKM>1且Length≤303nt的RNA进行筛选，作为候选的smRNAs库。3.根据权利要求2所述的海洋链霉菌S187中小蛋白预测和鉴定方法，其特征在于，在步骤1.3)中，将活化后的菌种制备发酵种子液包括以下步骤：种子液接取：取TSB固体培养基活化好的S187菌块，加至TSB液体培养基，在210
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230rpm震荡培养，36h后取样接取发酵液；发酵液接取：取种子液加至M33培养基，在170
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190rpm震荡培养，每48h转速增加20rpm，直至加至210
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230rpm后转速维持不变。4.根据权利要求2所述的海洋链霉菌中小蛋白预测和鉴定方法，其特征在于，在步骤1.3)中，取样、洗脱、保藏包括以下步骤：
1.3.1)从同一批次的六瓶发酵液中取三瓶长势良好的取样，每瓶取样3mL加到同一50mL离心管中并混匀，剩余三瓶发酵液中其中一瓶取样9mL至50mL离心管，后续处理与第一瓶一致以用于配平，其余两瓶均取样10mL至离心管以待萃取旋蒸后检测产物，整个实验流程中离心管应一直放置于冰浴中；1.3.2)去除培养基中蛋白质：离心，并弃去上清；1.3.3)PBS洗脱：向离心沉淀中加入预冷的PBS溶液混合均匀，然后加入PBS涡旋振荡，离心并弃去上清；1.3.4)重复步骤1.3.3)一次；1.3.5)去除CaCO3：加入预冷的PBS溶液混合均匀，然后加入PBS涡旋振荡，离心并弃去沉淀，最后转移样品至新的离心管中；1.3.6)再重复步骤1.3.3)一次，进行洗脱；1.3.7)离心管吊入液氮罐中速冻，低温保存。5.根据权利要求1所述的海洋链霉菌S187中小蛋白预测和鉴定方法，其特征在于，步骤2)包括以下过程：2.1)微肽的富集与处理：小蛋白多肽提取：按发酵时间取样分离得到的S187菌丝体样本破碎，然后用甲醇：氯仿：水＝3：1：4(V：V)提取小肽；涡旋，离心；收集上层水性上清液，用截留分子量为10KD的MWCO在离心力在20000
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g的条件下离心并取下层溶液，真空浓缩，干燥；脱盐冻干；HPLC分馏分：每个样本取一部分肽段混合，然后通过高效液相色谱，将肽段分离成多个馏分；2.2)多肽组测序：DDA质谱上机：配制流动相A相和B相；使用10μL A相溶解冻干粉末，4℃下14000g离心20min，取上清1μg样品进样，液质连用检测；DIA质谱上机和搜库：使用0.1％甲酸水溶液溶解多肽干粉并加入iRT标准肽段，取1μg样品进样，进行液相和质谱联用检测。6.根据权利要求1所述的海洋链霉菌S187中小蛋白预测和鉴定方法，其特征在于，步骤3)包括以下步骤：3.1)数据库搜索鉴定SEPs：使用t检验对样品多肽的定量值进行差异分析，卡Pvalue≤0.05，Foldchange≥1.5，得到差异肽段，再根据肽段差异情况使用投票法对其对应的蛋白的上下调情况进行统计，并筛选氨基酸序列长度在100aa以下的小蛋白作为所鉴定到的SEPs。7.根据权利要求6所述的海洋链霉菌S187中小蛋白预测和鉴定方法，其特征在于，步骤3)还包括以下步骤：3.2)De novo测序重分析：根据多肽组测序得到的质谱数据，使用de novo sequencing对质谱数据进行了重分析，以检测到数据库中可能不包含的novel SEPs，测序结果和从头测序中novel SEPs筛选过程如下：3.2.1)De novo测序主要参数设置：使用PEAKS Studio多肽组测序质谱数据进行重分析，使用de novo sequencing的方法根据质谱分子量对肽段进行序列鉴定，并使用PEAKSDB...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏春，赵心清，
申请(专利权)人：陕西师范大学，
类型：发明
国别省市：