本发明专利技术公开一种直接测定高密度脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇的方法，采用优化浓度和比例的聚乙烯硫酸三钾（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｓｕｌｐｈａｔｅＫ－ｓａｌｔ，ＰＶＳ）和聚乙二醇独甲醚（Ｍｅｔｈｏｘｙｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ，ＰＥＧＭＥ），即优化的化学沉淀法，联合对高密度脂蛋白胆固醇或低密度脂蛋白胆固醇反应性较好的表面活性剂进行特异性的高密度脂蛋白胆固醇或低密度脂蛋白胆固醇的含量测定。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及对高密度脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇的改良 的测定方法及相关试剂盒。
技术介绍
血浆中胆固醇的存在和运输形式为血浆脂蛋白，即血浆中非极性 的脂类包括胆固醇和亲水性的载脂蛋白结合，使得脂蛋白有较强的水 溶性可以在血中运输。血浆脂蛋白可以分为高密度脂蛋白、低密度脂 蛋白、极低密度脂蛋白和乳糜颗粒四种，其中低密度脂蛋白主要负责 将胆固醇运输至外周组织，而高密度脂蛋白是清除动脉壁上的胆固醇 向肝脏运输。流行病学和临床研究表明，低密度脂蛋白胆固醇水平与 动脉硬化类疾病冠心病的发生率成正相关，高密度脂蛋白胆固醇与动 脉硬化类疾病冠心病的发生率成负相关，即具有抗动脉硬化活性。因此高密度脂蛋白胆固醇HDL-C、低密度脂蛋白胆固醇LDL-C是当前临 床实验室血脂测定中最有价值的心脑血管疾病的危险因素指标。测定高低密度脂蛋白胆固醇的方法很多，包括超离心法、色谱法、 电泳法和沉淀法等。超离心法可作为基本的定量法使用，它使用超速 离心机进行分离，根据比重的差别分离LDL或HDL，进而测定其中的 胆固醇含量；而后来发展的电泳法以醋酸纤维膜或琼脂糖凝胶等做载 体分离，然后根据酶法测定胆固醇含量；在沉淀法中，沉淀剂凝结除 高密度脂蛋白以外的脂蛋白，凝结的脂蛋白通过离心分离沉淀，根据 酶反应测定上清即高密度脂蛋白胆固醇的含量；测定低密度脂蛋白胆 固醇的第一代化学沉淀法，采用PVS和PEGME沉淀LDL，用离心分 离法收集沉淀物，然后根据酶反应测定其中的胆固醇含量；以上方法 均需要特殊仪器，包括超速离心机、电泳仪和离心机等，操作复杂， 难于自动化，从而无法在临床实验室开展。
技术实现思路
本专利技术所涉及的直接测定高密度脂蛋白胆固醇的方法，是用优化的聚乙烯硫酸三钾PVS化学沉淀法联合对高密度脂蛋白胆固醇反应性 较好的第一表面活性剂，采用优化浓度的聚乙烯硫酸三钾(PVS)和聚 乙二醇独甲醚(PEGME)联合其他化合物将HDL以外的脂蛋白胆固 醇包裹不溶于水但又不至于沉淀，在对高密度脂蛋白胆固醇反应性较 好的第一表面活性剂的作用下溶解高密度脂蛋白胆固醇利用酶反应测 定其中胆固醇的含量。本方法所涉及的直接定量低密度脂蛋白胆固醇 的方法，采用优化的PVS沉淀法，仅包裹LDL使其无法参与酶反应， 但不会沉淀LDL即形成不溶物，然后LDL中的胆固醇成分在第一和 第二表面活性剂的联合作用下直接测量；详细而言，即高密度脂蛋白、 极低密度脂蛋白和乳糜微粒中的胆固醇在对低密度脂蛋白以外的脂蛋 白胆固醇反应性较好的第一表面活性剂的作用下参与胆固醇脂酶反 应，低密度脂蛋白胆固醇在第二表面活性剂的作用下溶解释放以进行 酶反应法测定其胆固醇含量。酶反应中第一步产生的过氧化氢不必使 用过氧化物酶去除，所以在第二步中不必加入抑制过氧化物酶活性的 叠氮钠。本专利技术中可以使用生物防腐剂。本专利技术的方法中均无需标本 前处理即沉淀和离心，可以直接在自动生化仪测定标本中的高密度脂 蛋白胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇。本专利技术所用的优化的聚乙烯硫酸三钾PVS化学沉淀法即优化浓度 和比例的PVS和PEGME，在检测高密度脂蛋白胆固醇时，其优化后 的PVS: PEGME比例为1: 500-550，浓度分别为10-20mg/L和5g-llg/L; 同时可以联合特殊的化合物将LDL、 VLDL和CM包裹不溶于水但又 不至于沉淀，所用的化合物为对低密度脂蛋白、极低密度脂蛋白和乳 靡颗粒亲和性较好的化合物，包括聚阴离子、环糊精硫酸盐、葡聚糖 硫酸盐和皂苷类化合物等，这些物质的使用量不受特别限制，根据物 质种类及组合方式而不同，尽量选用凝结或混浊少的组合；为进一步 提高特异性，还可以同时添加二价的金属离子盐，包括0.1mM-20mM 的镁盐、钙盐等，优先选用镁盐。直接测定低密度脂蛋白胆固醇时，采用优化浓度和比例的PVS和PEGME包裹LDL，优化后的比例为1: 400-500，浓度分别为l-20mg/L 和4g-10g/L;同时为了避免VLDL的共同被包裹，采用能掩蔽二价阳 离子的金属螯合剂包括EDTA或EGTA等，其使用浓度为0.1mM-2mM; 其他只要是和低密度脂蛋白亲和性较强的化合物，可以是促使其凝聚 的聚阴离子、肝素钠、磷钨酸、环糊精硫酸盐等，或对其有较强亲和 力又不导致沉淀产生的皂苷类化合物也可以使用，它们可以单独使用 或两种或以上组合使用，这些物质的使用量不受特别限制，根据物质 种类及组合方式而不同，尽量选用凝结或混浊少的组合；同时为了生 化仪的维护要求，尽量不使用或使用低浓度的镁离子。对于第一表面活性剂的选用，可以是离子或非离子的选择性表面 活性剂，可以是对高密度脂蛋白有较好反应性的表面活性剂或对低密 度脂蛋白以外的脂蛋白有较好反应性的表面活性剂，如聚氧乙烯类衍 生物或聚氧乙烯-聚氧丙烯的縮合物，包括聚氧乙烯高级醇醚、聚氧乙 烯月桂基醚、聚氧乙烯十六烷基醚、聚氧乙烯油基醚、聚氧乙烯烷基 醚、聚氧乙烯烷基苯基醚、聚氧乙烯亚烷基苯基醚、聚氧乙烯亚烷基 三苯基醚或聚氧乙烯烷基醚硫酸盐等。对于第二表面活性剂的选用， 其是可以与所有脂蛋白反应或至少可以与低密度脂蛋白反应的表面活 性齐(J，如L121，或Triton XI00、 Tween 20、 lipomin LA、 Anhitol 24B 和胆酸等。作为这些表面活性剂的商业上可得到的产品实例，包括 Emulgen系列如Emulgen108、 Emulgen220、 Emulgen 913、 Emulgen709、 Emulgen B66 、 Emulgen A60 (或A6系列)、Emulgen A90 (或A9系列)、 Emulgen 911 、Emulgen L-40等，和pluronic系歹廿如Pluronic F88、Pluronic F68、 Pluronic L121、 Pluronic L123、 Pluronic LlOl、 Pluronic L108等禾口 Triton X100等。这些表面活性剂可以单独使用或者两种或以上组合使 用。这些表面活性剂的用量没有特别限制， 一般来说，表面活性剂的 浓度优选为0.01X—3Xw/v之间。特别优选的浓度为0.05%-l%w/v。胆固醇反应应用胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶进行，生成的过氧化 氢在过氧化物酶作用下用4-氨基安替比林和高敏感度色原进行吸光度 分析测定，并计算出高密度脂蛋白胆固醇或低密度脂蛋白胆固醇的含 量。作为商业上可得到的色原包括日本同仁化学的N-乙基-N- (2-羟基 陽3画磺丙基)-间苯甲胺(TOOS)、 N- (2-羟基-3-磺丙基)-3， 5-二甲氧基苯胺(HDAOS)、 N-乙基-N- (3-甲基苯基)-N，-琥珀酰基乙二胺 (EMSE)等。作为这些色原的浓度，优选0.1mM-10mM。用于高密度脂蛋白胆固醇或低密度脂蛋白胆固醇定量的试剂，除 含有以上所属化合物、表面活性剂、酶及色原等外，其所采用的缓冲 液为Goods缓冲液，例如有HEPES、 MES、 MOPS禾卩PIPES等。缓冲 液的pH为5-10，优选为6-8。缓冲液的浓度为5-200mM,优选为 20mM-100mM。附图说明图1显示采用本专利技术的检测高密度脂蛋白胆固醇的试剂盒1检测本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种测定样品中高密度脂蛋白胆固醇或低密度脂蛋白胆固醇的含量的方法，其步骤为： １）用优化浓度和比例的聚乙烯硫酸三钾和聚乙二醇独甲醚与所述的样品接触； ２）在不形成沉淀的条件下联合至少一种表面活性剂通过酶法测定所述样品中高密度脂蛋 白胆固醇或低密度脂蛋白胆固醇的含量。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙国敬，
申请(专利权)人：北京九强生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]
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