一种快速高效的豌豆毛状根体系诱导和扩繁的方法技术

本发明专利技术公开了一种快速高效的豌豆毛状根体系诱导和扩繁的方法，涉及扩繁技术领域。本发明专利技术所述方法包括如下步骤：将豌豆土培苗的外植体用活化的发根农杆菌侵染液侵染，将经侵染后的外植体接种于共培养的培养基上暗培养24～48h，将经暗培养的外植体转移至发根诱导培养基上诱导培养，将经诱导培养产生的毛状根进行继代培养和扩增培养，从而获得大量豌豆毛状根。本发明专利技术提供一种土培苗直接诱导毛状根方法，适用于多种豌豆品种的毛状根的诱导，具有取材方便、诱导速度快、遗传稳定及节约成本等优点，通过直接诱导豌豆土培苗，实现土培苗豌豆毛状根快速、高效的诱导和扩繁。高效的诱导和扩繁。高效的诱导和扩繁。

【技术实现步骤摘要】
一种快速高效的豌豆毛状根体系诱导和扩繁的方法


[0001]本专利技术属于扩繁
，具体涉及一种快速高效的豌豆毛状根体系诱导和扩繁的方法。

技术介绍

[0002]豌豆作为重要的经济作物，目前，对豌豆的育种研究方兴未艾，利用植物遗传转化体系对豌豆进行遗传改良一直以来都是大家关注的热点。豌豆再生体系育种周期过长，而且需要各种植物激素。利用发根农杆菌直接诱导豌豆外植体，可以实现豌豆毛状根体系的快速繁殖作，能直观的观察和研究豌豆毛状根体系和相关基因的功能验证。
[0003]目前，对豌豆毛状根的诱导，多采用无菌苗的形式。其中，相关文献报道多采用无菌苗进行处理，无菌苗成本较高，且对菌体污染和烟苗生长要求很高，需要相关仪器设备，不利于研究和生产，从而制约了毛状根的诱导效率。近年来，相关文献报道了发根农杆菌(ARqua1、K599)可以诱导豌豆无菌苗发根，但并未有相关文献报道土培苗可以直接诱导豌豆毛状根方法。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种快速高效的豌豆毛状根诱导和扩繁的方法，通过直接诱导豌豆土培苗，实现土培苗豌豆毛状根快速、高效的诱导，适用于多种豌豆品种的毛状根的诱导。
[0005]为解决上述技术问题，本专利技术是采用下述技术方案实现的：
[0006]本专利技术提供一种快速高效的豌豆毛状根诱导和扩繁的方法，所述方法包括如下步骤：
[0007]将豌豆土培苗的外植体用活化的发根农杆菌侵染液侵染；
[0008]将经侵染后的外植体接种于共培养的培养基上暗培养24～48h；
[0009]将经暗培养的外植体转移至发根诱导培养基上诱导培养；
[0010]将筛选出来含有毛状根植株的毛状根进行继代培养和扩增培养；
[0011]作为一种优选实施方式，所述侵染液采用50mL OD值(600)0.8发根农杆菌进行离心，用等体积MS液体进行重悬制得。
[0012]作为一种优选实施方式，所述发根农杆菌包括A4、R1000、R1601、K599中的任意一种。
[0013]作为一种优选实施方式，将豌豆土培苗的叶片剪成(1～2)cm
×
(1～2)cm，加入侵染液中，侵染5～10min后，进行共培养。
[0014]作为一种优选实施方式，将经侵染后的外植体在暗培养结束后，转移至含有50mg/mL头孢1/2MS培养基培养基中，培养2～3周。
[0015]作为一种优选实施方式，所述诱导培养基组分如下：
[0016]20
×
大量元素母液：NH4NO333.0 g，KNO338.0 g，MgSO4·
7H2O 7.4g，KH2PO43.4g；
[0017]200
×
微量元素母液：KI 0.166g，H3BO31.24 g，MnSO4·
4H2O 4.46g，ZnSO4·
7H2O 1.72g，Na2MnO
·
2H2O 0.05g，CuSO4·
5H2O 0.005g，CoCl2·
6H2O0.005g；
[0018]200
×
铁盐母液：FeSO4·
7H2O 5.56g，EDTA
‑
Na2·
2H2O 7.46g；
[0019]200
×
有机母液：肌醇20.0g，烟酸0.1g，VB60.1 g，VB10.1 g，甘氨酸0.4g；
[0020]20
×
钙盐母液：CaC126.64 g；
[0021]所述诱导培养基的制备方法如下：
[0022]组分称量后，使用去离子水溶解并定容到1L，之后121℃高温灭菌15min备用；
[0023]MS液体培养基的配制：
[0024]20
×
大量元素母液50mL，200
×
微量元素母液5mL；
[0025]200
×
铁盐母液5mL，20
×
Ca盐母液50mL；
[0026]200
×
有机母液5mL，调pH到5.8
‑
6.2。(容到1L容量瓶中)
[0027]作为一种优选实施方式，所述豌豆土培苗为3～4周龄土培苗。
[0028]与现有技术相比，本专利技术所达到的有益效果：
[0029]1、本专利技术提供的一种快速高效的豌豆毛状根诱导和扩繁的方法，所述方法包括如下步骤：将豌豆土培苗的外植体用活化的发根农杆菌侵染液侵染；将经侵染后的外植体接种于共培养的培养基上暗培养24～48h；将经暗培养的外植体转移至发根诱导培养基上诱导培养；将经诱导培养产生的毛状根进行继代培养和扩增培养，利用发根农杆菌诱导豌豆土培苗产生毛状根。
[0030]2、本专利技术提供的一种快速高效的豌豆毛状根诱导和扩繁的方法，通过研究发现，侵染液采用50mL OD值(600)0.8发根农杆菌进行离心，并用等体积MS液体进行重悬制得，所述发根农杆菌(A4、R1000、R1601、K599)的在OD值在0.8时，能够高效诱导出毛状根，且A4农杆菌诱导效率最高，可以达到70％的诱导率，诱导的毛状根可以持续生产，作为生化反应器进行相关实验探究。
[0031]3、本专利技术提供的一种快速高效的豌豆毛状根诱导和扩繁的方法，适用于多种豌豆品种的毛状根的诱导，具有取材方便、诱导速度快、遗传稳定及节约成本等优点，通过诱导豌豆土培苗，实现土培苗豌豆毛状根快速、高效的诱导和扩繁。
[0032]通过对比MS、1/2MS、1/4MS、B5培养基发现1/2MS配养基效果最好。
附图说明
[0033]图1是本专利技术实施例提供的采用一种快速高效的豌豆毛状根诱导和扩繁的方法对土培苗外植体的诱导过程示意图；图中：A：4周的豌豆幼苗；B：诱导7d发根的外植体；C：14d以后的毛状根；D：21d以后转移到筛选培养基；E：28d长出毛状根植株；F:42d以后的毛状根植株；G:60d以后的毛状根植株。
具体实施方式
[0034]下面将对本专利技术作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本专利技术的技术方案，而不能以此来限制本专利技术的保护范围。
[0035]以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业
途径得到。
[0036]需要说明的是，所述诱导培养基组成如下：
[0037]20
×
大量元素母液：NH4NO333.0 g，KNO338.0 g，MgSO4
·
7H2O 7.4g，KH2PO43.4 g；
[0038]200
×
微量元素母液：KI 0.166g，H3BO31.24 g，MnSO4
·
4H2O 4.46g，ZnSO4
·
7H2O 1.本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种豌豆毛状根诱导和扩繁的方法，其特征在于，包括以下步骤：以豌豆土培幼苗的嫩组织为外植体，经发根农杆菌侵染后，于共培养基上暗培养24～48h；将经暗培养的外植体转移至发根诱导培养基上诱导培养，得毛状根植株；所述共培养基为改良1/2MS培养基；所述发根诱导培养基为含头孢的1/2MS培养基。2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述豌豆土培幼苗为3～4周龄苗；所述嫩组织包括叶片。3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，利用发根农杆菌制备得到的侵染液进行侵染，所述侵染液的制备方法：包括利用OD
600
为0.8的发根农杆菌的菌液进行离心，菌体与等体积MS液体混合重悬，得所述侵染液。4.根据权利要求1或3所述方法，其特征在于，所述侵染的时间为5～10min。5.根据权利要求4所述方法，其特征在于，所述发根农杆菌的种类包括A4、K599、R1601、R1000中的任意一种。6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，每L所述MS培养基由20
×
大量元素母液50mL，200
×
微量元素母液5mL，200
×
铁盐母液5mL，20
×
Ca盐母液50mL和200
×
有机母液5mL组成，调pH到5.8
‑
6.2；每L所述20
×
大量元素母液包括以下组成：NH4NO
3 33.0g，KNO
3 38.0g，MgSO4·
7H2O 7.4...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴晓宗，郝莉花，李隆，李佩霖，徐健博，王鑫，贾泽康，范元鑫，石佳明，
申请(专利权)人：郑州轻工业大学，
类型：发明
国别省市：