用于急性心肌梗死相关microRNA检测的电化学生物传感器制造技术

本发明专利技术提供一种用于急性心肌梗死相关microRNA检测的电化学生物传感器。本发明专利技术利用四面体DNA支架将分子识别限制在纳米尺度内，降低分子扩散，提高分析方法的灵敏度和缩短检测时间。本发明专利技术构建一种灵敏、快速AMI相关microRNA检测方法，为AMI相关microRNA检测技术的研发提供实验依据和技术支撑。术的研发提供实验依据和技术支撑。术的研发提供实验依据和技术支撑。

【技术实现步骤摘要】
用于急性心肌梗死相关microRNA检测的电化学生物传感器


[0001]本专利技术涉及电化学检测
，具体涉及一种基于四面体DNA支架的空间限制效应用于急性心肌梗死相关microRNA检测的电化学生物传感器及其检测方法。

技术介绍

[0002]急性心肌梗死(AMI)是一种由冠状动脉急性、持续性缺血和缺氧引起的心肌损伤，由于发病突然，诊断延迟以及不确定性诊断是导致AMI高发病率和死亡率的主要原因，因此AMI被认为是一种主要的公共卫生问题。AMI血运重建治疗对于缺血心肌的修复至关重要，可显著降低AMI患者的死亡率。AMI血运重建治疗依赖于早期、及时、准确的AMI识别和诊断。AMI引起的心脏损伤与心肌细胞的进行性损失相关，会诱导肌红蛋白、肌酸激酶同工酶(CK
‑
MB)、心脏脂肪酸结合蛋白(H
‑
FABP)等生物标志物随时间依赖性释放。然而，蛋白质生物标志物的水平可能受到一些非心脏疾病的影响，其低特异性可能导致误诊。近年来，许多生物学研究证明，一些microRNA的异常表达与AMI的发病机制密切相关。与蛋白质生物标志物相比，AMI相关microRNA具有更高的特异性和及时性，因此microRNA是诊断AMI的更为优异的生物标志物。然而，AMI相关microRNA在疾病早期的表达极低，并且准确检测受到其他同源microRNA的干扰。因此，提高AMI相关microRNA检测技术的灵敏度和缩短分析时间至关重要。
[0003]通常，提高microRNA检测方法的灵敏度依赖于开发信号放大策略，比如利用纳米材料或酶催化放大生物识别信号，亦或是采用核酸信号扩增增加生物标志物的数量，但往往会延长检测时间。因此，microRNA的检测方法面临着灵敏度低和检测时间长的双重挑战。电化学生物传感器结合生物识别的高选择性与电化学技术的高灵敏度，已被证明具有实现循环生物标志物灵敏检测的潜力。研究表明，由于分析物分子到传感界面的质量传输缓慢导致响应时间延长。扩散过程的时间尺度与扩散物质的扩散路径长度的平方成正比。往往需要更大的取样体积来确保分析低浓度分析物的准确性。近年来，研究者们采用纳米结构电极来延长传感界面的长度尺度，或采用磁性纳米颗粒减少扩散路径长度。然而，异质界面会导致杂交效率降低。

技术实现思路

[0004]为了解决现有技术中的问题，本专利技术提供一种用于急性心肌梗死相关microRNA检测的电化学生物传感器。本专利技术利用四面体DNA支架将分子识别限制在纳米尺度内，降低分子扩散，提高分析方法的灵敏度和缩短检测时间。在本工作中四种反应链被添加到四面体DNA支架的四个顶点，其中DNA杂交反应被限制四面体DNA支架中，由于扩散路径的减少和信号的增强，DNA杂交反应效率和分析性能大大提高。此外，传感器的构建过程是一步孵育过程，因此不需要额外的试剂和扩增产物的转移，大大降低了操作难度。本研究构建一种灵敏、快速AMI相关microRNA检测方法，为AMI相关microRNA检测技术的研发提供实验依据和技术支撑。
[0005]一种用于急性心肌梗死相关microRNA检测的电化学生物传感器，其特征在于：
[0006]将TDS
‑
DNAzyme/blocker复合物滴加在还原氧化石墨烯/Nafion修饰的玻碳电极rGO/Nafion/GCE表面，室温孵育2～3h，制备得到用于microRNA
‑
499检测的电化学生物传感器。
[0007]所述TDS
‑
DNAzyme/blocker复合物的制备步骤为：DBCO
‑
DNAzyme/blocker双链、TDS和辣根过氧化物酶HRP标记的链霉亲和素HRP
‑
conjugated streptavidinin在固定缓冲液(10mM Tris
‑
HCl，1M NaCl，1mM EDTA，10mM TECP，pH 7.4)中混合，置于梯度PCR仪中20～25℃孵育20～30min得TDS
‑
DNAzyme/blocker复合物。
[0008]所述rGO/Nafion/GCE的制备：
[0009]氧化石墨烯悬浮液与Nafion
TM
全氟化树脂溶液混合得到氧化石墨烯/Nafion混合液，然后将氧化石墨烯/Nafion混合液滴在预处理的GCE表面，在真空干燥仪中干燥后制得氧化石墨烯/Nafion修饰的玻碳电极(GO/Nafion/GCE)，将GO/Nafion/GCE置于磷酸盐缓冲盐水中进行电化学还原，得到还原氧化石墨烯/Nafion修饰的玻碳电极(rGO/Nafion/GCE)。
[0010]所述TDS的制备方法为：
[0011]将四条单链DNA T1、T2、T3和T4以等摩尔比例混合在组装缓冲液(20mM Tris
‑
HCl，50mM MgCl2，pH 8.0)中，然后置于梯度PCR仪中退火，降温至3～5℃后维持60～90min。
[0012]进一步，上述TDS
‑
DNAzyme/blocker复合物的制备包括如下步骤：
[0013]1)叠氮基、芘分子和生物素化TDS的制备：将四条单链DNA T1、T2、T3和T4以等摩尔比例混合在组装缓冲液(20mM Tris
‑
HCl，50mM MgCl2，pH 8.0)中，然后置于梯度PCR仪中退火，降温至3～5℃后维持60～90min；
[0014]T1、T2、T3、T4的DNA序列如下：
[0015][0016][0017]2)DBCO
‑
DNAzyme/blocker的制备：使用杂交缓冲液(10mM Tris
‑
HCl，20mM MgCl2，100mM NaCl，pH 7.4)分散DBCO
‑
DNAzyme和blocker链，将blocker和DBCO
‑
DNAzyme等体积混合，然后置于梯度PCR仪中退火，冷却至20～25℃，降温速率为
‑
1～
‑
2℃/min，制成DBCO
‑
DNAzyme/blocker；
[0018]3)TDS
‑
DNAzyme/blocker复合物的制备：将步骤1)所制产物、步骤2)所制DBCO
‑
DNAzyme/blocker双链和辣根过氧化物酶HRP标记的链霉亲和素(HRP
‑
conjugatedstreptavidinin)在固定缓冲液(10mM Tris
‑
HCl，1M NaCl，1mM EDTA，10mM TECP，pH7.4)中混合，置于梯度PCR仪中20～25℃孵育20～30min即得TDS
‑
DNAzyme/blocker复合物。
[0019]上述rGO/Nafion/GCE的制备步骤为：
[0020]本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于急性心肌梗死相关microRNA检测的电化学生物传感器，其特征在于：将TDS
‑
DNAzyme/blocker复合物滴加在还原氧化石墨烯/Nafion修饰的玻碳电极rGO/Nafion/GCE表面，室温孵育2～3h，制备得到用于microRNA
‑
499检测的电化学生物传感器；所述TDS
‑
DNAzyme/blocker复合物的制备步骤为：DBCO
‑
DNAzyme/blocker双链、TDS和辣根过氧化物酶HRP标记的链霉亲和素HRP
‑
conjugated streptavidinin在固定缓冲液中混合均匀，置于梯度PCR仪中20～25℃孵育20～30min得TDS
‑
DNAzyme/blocker复合物；所述固定缓冲液含有10mM Tris
‑
HCl、1M NaCl、1mM EDTA和10mM TECP，固定缓冲液的pH 7.4；所述rGO/Nafion/GCE的制备：氧化石墨烯悬浮液与Nafion
TM
全氟化树脂溶液混合得到氧化石墨烯/Nafion混合液，然后将氧化石墨烯/Nafion混合液滴在预处理的GCE表面，在真空干燥仪中干燥后制得氧化石墨烯/Nafion修饰的玻碳电极(GO/Nafion/GCE)，将GO/Nafion/GCE置于磷酸盐缓冲盐水中进行电化学还原，得到还原氧化石墨烯/Nafion修饰的玻碳电极rGO/Nafion/GCE；所述TDS的制备方法为：将四条单链DNA T1、T2、T3和T4以等摩尔比例混合在组装缓冲液中，然后置于梯度PCR仪中退火，降温至3～5℃后维持60～90min；所述组装缓冲液含有20mM Tris
‑
HCl和50mM MgCl2，组装缓冲液的pH 8.0；T1、T2、T3、T4的DNA序列如下：2.如权利要求1所述的的电化学生物传感器，其特征在于，所述TDS
‑
DNAzyme/blocker复合物的制备包括如下步骤：1)叠氮基、芘分子和生物素化TDS的制备：将四条单链DNA T1、T2、T3和T4以等摩尔比例混合在组装缓冲液中，然后置于梯度PCR仪中退火，降温至3～5℃后维持60～90min；所述组装缓冲液含有20mM Tris
‑
HCl和50mM MgCl2，组装缓冲液的pH 8.0；2)DBCO
‑
DNAzyme/blocker的制备：使用杂交缓冲液分散DBCO
‑
DNAzyme和blocker链，将blocker和DBCO
‑
DNAzyme等体积混合，然后置于梯度PCR仪中退火，冷却至20～25℃，降温速率为
‑
1～
‑
2℃/min，制成DBCO
‑
DNAzyme/blocker；所述杂交缓冲液含有10mM Tris
‑
HCl、20mM MgCl2和100mM NaCl，杂交缓冲液的pH 7.4；3)TDS
‑
DNAzyme/blocker复合物的制备：将步骤1)所制产物、步骤2)所制DBCO
‑
DNAzyme/blocker双链和辣根过氧化物酶HRP标记的链霉亲和素在固定缓冲液中混合，置于
梯度PCR仪中20～25℃孵育20～30min即得TDS
‑
DNAzyme/blocker复合物；所述固定缓冲液含有10mM Tris
‑
HCl、1M NaCl、1mM EDTA和10mM TECP，固定缓冲液的pH 7.4。3.如权利要求1所述的的电化学生物传感器，其特征在于，所述rGO/Nafion/GCE的制备步骤为：氧化石墨烯悬浮液与Nafion
TM
全氟化树脂溶液混合得到氧化石墨烯/Nafion混合液，然后将氧化石墨烯/Nafion混合液滴在预处理的GCE表面，在真空干燥仪20
‑
25℃干燥后制得氧化石墨烯/Nafion修饰的玻碳电极GO/Nafion/GCE，将GO/Nafion/GCE置于10mM pH 5.0的磷酸盐缓冲盐水中进行电化学还原，使用i
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t安培测量，其中初始电位为
‑
1.3V，取样间隔为0.1s，静置时间为0s，得到还原氧化石墨烯/Nafion修饰的玻碳电极rGO/Nafion/GCE。4.如权利要求1所述的的电化学生物传感器，其特征在于，所述还原氧化石墨烯的制备步骤为：将片状的单层氧化石墨烯分散于超纯水中，经超声处理30
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40min后得到氧化石墨烯悬浮液，随后将氧化石墨烯悬浮...

【专利技术属性】
技术研发人员：卿敏，白丽娟，李悦媛，
申请(专利权)人：重庆医科大学，
类型：发明
国别省市：