有害赤潮生物细胞表面特异性抗体及其制备方法技术

有害赤潮生物细胞表面特异性抗体及其制备方法，涉及一种抗体。提供一种有害赤潮生物细胞表面特异性抗体及其制备方法。抗体为机体在赤潮藻表面抗原物质刺激下，由Ｂ细胞分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白。先制备不被胞内蛋白污染的东海原甲藻和链状亚历山大藻全细胞表面抗原，再与完全福式佐剂混合，将混合液注射入新西兰白兔内，注射抗原后再强化注射；于收集抗体血清之前的３～８天收集新西兰白兔耳静脉血液，检测抗体产生情况；最后一次注射后的第３～５天收集实验兔的全血液，静置，离心，收集血清后分装，贮存。对于藻类赤潮，利用该抗体可以迅速的检测相对应的赤潮藻种，检测极限可以达到十几个细胞。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种抗体，尤其是涉及一种具有高特异性和灵敏度的有害赤潮生物细胞表面 特异性抗体及其制备方法。
技术介绍
目前，有害赤潮藻的抗体制备已有报道。亓海刚等(亓海刚，米铁柱，辛泽毓，等.赤潮异弯藻抗体的制备及酶联免疫检测方法的建 立.海洋学报，2006， 28(5): 167-172)报道了制备赤潮异弯藻抗体。向军俭等(向军俭，凌钦婕，吕颂辉，等.四种赤潮藻多克隆抗体的制备及特异性分析. 暨南大学学报，2005， 26(5): 700-704)制备了四种赤潮藻的抗体血清及赤潮藻的单克隆抗体。向军俭等(向军俭，朱小兵，吕颂辉，等.五种赤潮藻单克隆抗体的制备.暨南大学学报， 2003， 24(3): 103-108)还制备了五种赤潮藻单克隆抗体。但是涉及有害赤潮生物细胞表面抗体制备的相关技术鲜有报道，并且在有害赤潮生物细 胞表面抗体制备过程中经常被细胞内蛋白污染，很难获得特异型高的抗体。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对现有的有害赤潮生物细胞表面抗体制备过程中容易被细胞内蛋白 污染，很难获得特异型高的抗体等问题，提供一种有害赤潮生物细胞表面特异性抗体及其制 备方法。本专利技术所述的有害赤潮生物细胞表面特异性抗体为机体在赤潮藻表面抗原物质刺激下， 由B细胞分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白。 本专利技术所述的有害赤潮生物细胞表面特异性抗体的制备方法包括以下步骤-1) 制备抗原抗原是一种能诱发机体产生特异性免疫反应的大分子物质，用多聚甲醛分别固定东海原 甲藻和链状亚历山大藻细胞表面蛋白，然后用PBS洗涤藻细胞，得不被胞内蛋白污染的东海 原甲藻和链状亚历山大藻全细胞表面抗原；2) 注射抗原将东海原甲藻和链状亚历山大藻全细胞表面抗原与完全福式佐剂混合，将混合液注射入43) 强化注射注射抗原后再强化注射，强化注射时东海原甲藻和链状亚历山大藻全细胞表面抗原与不 完全福式佐剂混合，其它操作与步骤2相同；4) 检测抗体效价于收集抗体血清之前的3 8天收集新西兰白兔耳静脉血液，检测抗体产生情况；5) 收集抗体血清最后一次注射后的第3 5天收集实验兔的全血液，静置，离心，收集血清后分装，贮存。 按质量百分比，多聚甲醛的浓度最好为0.5%。用PBS洗涤藻细胞最好至少2次。 抗原是一种能诱发机体产生特异性免疫反应的大分子物质，如蛋白质等。 按体积比，东海原甲藻和链状亚历山大藻全细胞表面抗原完全福式佐剂最好为1 : 1， 所述新西兰白兔最好是年龄为3 6个月的新西兰白兔；所述注射可采用皮下注射，注射的部 位最好为腋窝与腹股沟，注射的量最好每只兔子每次注入的藻个体数分别为1.0xl(^个东海原 甲藻和2.0><106个亚历山大藻。强化注射最好2 4次，每次强化注射的间隔时间为5 10天(以初次注射为第0天)。 检测抗体产生情况可采用酶联免疫检测方法(ELISA)检测。 收集实验兔的全血液可采用颈部动脉取血的方法，静置的时间最好为30min 2h。 本专利技术采用0.5%的多聚甲醛分别固定东海原甲藻和链状亚历山大藻细胞表面蛋白，然后 用PBS洗涤藻细胞，可以得到不被胞内蛋白污染的抗原。东海原甲藻和链状亚历山大藻细胞 膜会破碎，细胞内的蛋白溢出，并随着PBS洗脱掉，细胞内的蛋白不会作为抗原而产生抗体， 从而不会污染细胞表面抗原产生的抗体。采用PBS缓冲液洗漆抗原，可以使得细胞质内的蛋 白洗涤出来，包括一些毒素等。这是因为藻细胞洗过多聚甲醛固定后，会导致藻细胞的质膜 部分穿孔，从而使得细胞内的蛋白跑出。PBS的洗涤过程不会洗脱掉细胞表面蛋白，因为这 些蛋白经过多聚甲醛的固定，对蛋白质交联从而起到固定作用，保持细胞表面蛋白稳定、形 态结构完好。PBS洗涤抗原的步骤是非常重要的，没有洗涤的抗原会因为细胞内的蛋白在免 疫过程中形成抗体，从而会引起后面细胞表面蛋白的交叉反应。本专利技术方法的有益效果是，用多聚甲醛固定蛋白质的同时，使细胞表面各成分交联，保 持细胞结构度，并且用PBS很容易的洗涤除去胞内蛋白及其他污染，制备了无交叉反应的高 特异性有害赤潮藻表面抗体。对于藻类赤潮，利用该抗体可以迅速的检测相对应的赤潮藻种， 检测极限可以达到十几个细胞。附图说明图l是东海原甲藻抗体免疫荧光识别细胞表面蛋白图。在图1中，A、 B、 C是东海原甲藻全细胞、细胞壳壁、细胞质体免疫荧光图，D、 E、 F 是东海原甲藻全细胞、细胞壳壁、细胞质体明场图；标尺为2tim。 图2是链状亚历山大藻抗体免疫荧光识别细胞表面蛋白图。在图2中，G、 H、 I是链状亚历山大藻全细胞、细胞壳壁、细胞质体免疫荧光，J、 K、 F 是链状亚历山大藻全细胞、细胞壳壁、细胞质体明场图；标尺为4nm。 图3是东海原甲藻抗体免疫印迹识别细胞表面蛋白图。在图3中，A是链状亚历山大藻细胞表面蛋白银染图，B是链状亚历山大藻细胞表面蛋白 免疫印迹图。图4是链状亚历山大藻抗体免疫印迹识别细胞表面蛋白图。在图4中，C是东海原甲藻细胞壳表面蛋白银染图，D是东海原甲藻细胞表面蛋白免疫印 迹图。具体实施例方式以下实施例将结合附图对本专利技术作进一步的说明。本专利技术方法采用0.5%的多聚甲醛分别固定东海原甲藻(尸raroce欣"附A"g/^e"5e)和链状 亚历山大藻C4/m^n'鹏c她"e/to)细胞表面蛋白，细胞用0.5%多聚甲醛固定2 h或4。C过夜 后，以10,000g离心力收集藻液，去除固定液后，用PBS缓冲液洗涤3次，然后将藻液悬浮 于PBS缓冲液(磷酸缓冲液)中。将制备的东海原甲藻和链状亚历山大藻全细胞表面抗原与等体积的完全福式佐剂完全混 合。然后将混合液注射入选取的年龄为3 6个月的新西兰白兔内。注射采用皮下注射，注射 点分别为腋窝与腹股沟。每只兔子每次注入的藻个体数分别为1.0x107个东海原甲藻和 2.0x106个亚历山大藻。强化注射时间分别是在第14、 21、 49天(以初次注射为第0天)。强化注射时全细胞抗 原与不完全福式佐剂混合，其它操作与上相同。于第35天收集兔子耳静脉血液，检测抗体产 生情况。第59天，采用颈部动脉取血的方法收集实验兔的全血液。兔全血液收集后于室温静 置30min 2h后离心，收集血清后分装、贮存于一20。C冰箱中。东海原甲藻抗体与其它藻种的免疫荧光交叉反应结果参见表1，链状亚历山大藻抗体与 其它藻种的免疫荧光交叉反应结果参见表2。表1和表2中免疫荧光标记强度"3+"代表强标 记，"+，，代表低标记，"-"代表无标记，表1和2中没有中等标记。6表l藻种名称稀释度i:画E &慮麵 CCMPPfrfe对i蹦附March，1998 HK鹏'w"譲 HK i 附/oww DYW爿.efl敏e/to 爿.柳.w幽附C力/, C&ae阮ems sp+++3+3+7<table>table see original document page 8</column></row><table>权利要求1. 有害赤潮生物细胞表面特异性抗体，其特征在于为机体在赤潮藻表面抗原物质刺激下，由B细胞分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白。2. 如权利要求1所述的有本文档来自技高网...

【技术保护点】
有害赤潮生物细胞表面特异性抗体，其特征在于为机体在赤潮藻表面抗原物质刺激下，由Ｂ细胞分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王大志，陈荔，李成，黄旭光，洪华生，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：92[中国|厦门]