本发明专利技术属于植物组织和细胞培养技术领域。以草坪草品种日本结缕草（Ｚｏｙｓｉａ ｊａｐｏｎｉｃａ Ｓｔｅｕｄ）的成熟种子为外植体诱导愈伤组织，通过愈伤组织增殖（或通过长期继代），最后诱导分化为完整小植株。本发明专利技术包括下列步骤：ａ）在含有愈伤诱导剂的培养基中培养日本结缕草的成熟种子并诱导愈伤组织；ｂ）挑选状态良好的愈伤组织到增殖（或继代）培养基上增殖或继代；ｃ）挑选状态良好的经过增殖或者继代的愈伤组织到分化培养基上诱导成完整小植株。本发明专利技术还包括将增殖或继代培养基上的黄色脆性胚性愈伤接种到继代培养基上作长期继代并保持分化。与现有技术相比，本发明专利技术显著提高了结缕草外植体愈伤诱导率和植株再生的效率。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物组织培养和植株再生
，具体地说，本专利技术涉及以日本结缕草的成熟种子为外植体，通过愈伤组织诱导进行植株再生的方法以及用于该方法的培养基。
技术介绍
日本结缕草(Zoysia japonica Steud.)是草坪植物中应用较广泛、适应性较强的一个暖季型草种。其分布广、抗性强，在现代城市绿化、运动场建植及水土保持中都占有重要地位，但较短的青绿期成为限制其大量应用的瓶颈，利用现代生物技术，如遗传转化、原生质体融合、体细胞突变体的诱导等，对日本结缕草进行遗传改良，为日本结缕草种质的创新提供了广阔的空间。要对日本结缕草进行遗传转化及体细胞突变体的诱导，植株再生体系的建立是前提。现有技术中的日本结缕草植株再生方法通常是这样的将日本结缕草成熟胚接种在诱导培养基上诱导愈伤组织，对诱导出的愈伤组织进行继代培养，再将愈伤组织转入分化培养中诱导芽的产生(Al-KharyiJ M，Huang F H，Thompson L F，et al.Crop Science，1989，29(5)1324-1325；Asano Y.Plant cellRep，1989，8(3)141-143；Inokuma C，Sugiura K，Cho C，Okawara R，Kaneko S.Plant Cell Rep，1996，15737-741；李瑞芬等，结缕草愈伤组织诱导及植株再生，园艺学报，2003，30(3)355-357)。这些方法中产生的愈伤组织很难长期继代并保持分化能力，因而很难作为遗传转化的受体。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种离体培养日本结缕草的植株再生方法，特别是提供一种在离体培养条件下，通过成熟胚愈伤诱导进行日本结缕草植株再生的方法及用于该方法的培养基，该方法及其培养基能够使日本结缕草愈伤组织长期继代并保持良好分化成正常植株能力。本专利技术是这样实现的一种离体培养日本结缕草再生植株的方法，它包括下列步骤a)在含有诱导剂的培养基中培养日本结缕草的成熟种子，将其诱导出愈伤组织；b)挑选步骤a)得到的状态良好的愈伤组织接种到愈伤组织增殖培养基上使其增殖；c)挑选步骤b)得到的状态良好的愈伤组织接种到分化培养基上诱导芽丛，和d)将步骤c)得到的芽丛转入生根培养基中生根，使其成为完整植株。在本专利技术中解决愈伤组织长期继代培养并保持良好分化能力的技术措施是从增殖的愈伤组织中挑选黄白色、颗粒状、分散好的愈伤组织接种到长期继代培养基上，使该愈伤组织能够长期继代并保持分化能力。在本专利技术中，所述的培养基中的诱导剂选自2，4-二氯苯氧乙酸、6-苄基嘌呤或其组合。它们的适宜浓度为2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)为2-4mg/L，6-BA为0.02-0.05mg/L。在本专利技术中，所述的愈伤组织诱导培养基为N6的大量元素，MS的微量元素和有机成分，MS铁盐，水解乳蛋白500mg/L，脯氨酸500mg/L，2，4-D 2.0-4.0mg/L，6-BA 0.02-0.05mg/L，维生素B15.0mg/L，蔗糖30g/L，葡萄糖10g/L，固化琼脂粉8g/L，加水至1L，调pH值为6.0。所述的愈伤组织增殖培养基为MS基本培养基，水解乳蛋白500mg/L，脯氨酸500mg/L，2，4-D 1.5-2.5mg/L，维生素VB15.0mg/L，AgNO33.0mg/L，蔗糖30g/L，葡萄糖10g/L，固化琼脂粉8g/L，加水至1L，调pH值为6.0。所述的愈伤组织分化培养基为MS基本培养基，萘乙酸0.3mg/L，6-BA 1.0mg/L，蔗糖30g/L，固化琼脂粉7g/L，加水至1L，pH值为6.0。所述的愈伤组织长期继代培养基为MS基本培养基，萘乙酸0.3mg/L，激动素0.5mg/L，6-苄基腺嘌呤1.0mg/L，蔗糖30g/L，固化琼脂粉7g/L，加水至1L，调pH值为5.8。用于由分化的芽丛诱导生根的生根培养基为1/2MS基本培养基附加固化琼脂粉7g/L，加水至1L，调pH值为6.0。特别指出，在实施上述的技术专利技术步骤中，为了使日本结缕草的愈伤组织达到长期继代培养并保持良好的分化为植株的能力，应挑选黄白色、颗粒状、分散好的愈伤组织接种到继代培养基上，按照本专利技术所提示的方法培养。为了便于本专利技术的描述，上述各个步骤中，含有诱导剂、细胞分裂素的培养基分别称为愈伤组织诱导培养基、愈伤组织增殖培养基、分化培养基、生根培养基及继代培养基。用于配制上述各培养基的基础培养基是本领域技术人员熟知的常用培养基如MS培养基和N6培养基(培养基成分参见李明浚编译.植物组织培养，北京中国农业出版社，1992)。在本专利技术中根据各步骤的需要，基础培养基采用的主要是MS培养基(Murashige T.and F.Skoog.Physiol.Plant，1962，15473-497)和N6培养基(朱至清等.通过氮源比较实验建立一种较好的水稻花药培养基，中国科学，1975，(5)484-490)，但不应认为本专利技术的仅仅适用于该培养基。在上述方法中，诱导剂是本领域技术人员常用来诱导愈伤组织的诱导剂。诱导剂宜选用萘乙酸(简称NAA)、吲哚乙酸(IBA)，2，4-二氯苯氧乙酸(2、4-D)或其组合，较佳的诱导剂是2，4-二氯苯氧乙酸。2，4-D是影响外植体脱分化的关键因素，在本专利技术中，愈伤组织诱导发生阶段，培养基中必须加入2，4-D，浓度宜为2-4mg/L，添加一定量的细胞分裂素6-BA(浓度为0.01-0.02mg/L)能明显地提高有分化能力愈伤组织诱导率，但高浓度的6-BA(＞0.1mg/L)则对愈伤组织有一定的伤害，使愈伤组织不但诱导量小、褐化并会逐渐死亡。在上述方法中，愈伤组织的增殖阶段也必须加入适量的2，4-D，其浓度宜为1.5-2.5mg/L。上述诱导愈伤组织分化的细胞分类素和生长素是本领域技术人员所熟知的，在本专利技术的实践中，较佳的细胞分裂素是6-BA(6-苄基腺嘌呤)，其浓度宜为1.0mg/L，生长素为NAA，其浓度为0.3mg/L。在上述方法中，愈伤组织的长期继代培养基中2，4-D和KT(激动素)是关键激素，继代过程中在培养基中添加0.2mg/L 6-BA能使愈伤组织趋于分化，不利于愈伤组织的保存。而0.3-0.5gm/L KT则能使愈伤组织长期保存而不降低分化率。本专利技术可从日本结缕草成熟种子中高频诱导愈伤组织，愈伤组织增殖培养后接种入分化培养基可诱导芽丛分化，挑选增殖培养后具有芽点样物愈伤组织周围的愈伤组织进行继代培养，能长期保持这些愈伤组织的再生能力，截止到目前为止所继代的愈伤组织已继代(保存)了18个月。这些能保持高分化率的愈伤组织为以后的农杆菌介导的日本结缕草的遗传转化以及体细胞突变体的诱导提供了良好的受体。与已有的日本结缕草离体植株再生方法相比，本专利技术具有以下明显的效果1、所用的愈伤组织诱导和继代基本培养基以及培养基所附加的激素和附加物如所报道的技术文献不同；2、本专利技术制备的日本结缕草愈伤组织在本专利技术制备的继代和分化培养基上可长期继代保存并保持良好的分化能力。附图说明图1由结缕草成熟种子诱导的愈伤组织图2愈伤组织在增殖培养基上形成的微芽及其周围产生的愈伤组织图3将部分发育良好的具叶状体结构的微芽在1/2MS培养基上诱导本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种离体培养日本结缕草的植株再生方法，它包括下列步骤：ａ）在含有诱导剂的培养基中培养日本结缕草的成熟种子，将其诱导出愈伤组织；ｂ）挑选步骤ａ）得到的状态良好的愈伤组织接种到愈伤组织增殖培养基上使其增殖；ｃ）挑选步骤ｂ ）得到的状态良好的愈伤组织接种到分化培养基上诱导芽丛，和ｄ）将步骤ｃ）得到的芽丛转入生根培养基中生根，使其成为完整植株。
【技术特征摘要】
1.一种离体培养日本结缕草的植株再生方法，它包括下列步骤a)在含有诱导剂的培养基中培养日本结缕草的成熟种子，将其诱导出愈伤组织；b)挑选步骤a)得到的状态良好的愈伤组织接种到愈伤组织增殖培养基上使其增殖；c)挑选步骤b)得到的状态良好的愈伤组织接种到分化培养基上诱导芽丛，和d)将步骤c)得到的芽丛转入生根培养基中生根，使其成为完整植株。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，其中的方法包括挑选黄白色、颗粒状、分散好的愈伤组织接种到长期继代培养基上，使该愈伤组织进行长期继代并保持分化能力。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述诱导剂选自2，4-二氯苯氧乙酸、6-苄基嘌呤或其组合。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述2，4-D为2-4mg/L，6-BA为0.02-0.05mg/L。5.根据权利要求1所述的方法，其特征还在于，愈伤组织诱导培养基为N6的大量元素，MS的微量元素和有机成分，MS铁盐，水解乳蛋白500mg/L，脯氨酸500mg/L，2，4-D 2.0-4.0mg/L，6-BA 0.0...
【专利技术属性】
技术研发人员：包满珠，樊晓莉，张俊卫，刘国锋，高丽萍，胡惠蓉，王文恩，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]
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