通过施加电磁场使植物细胞染色体加倍制造技术

披露了用于通过施加电磁场使植物细胞的染色体加倍的方法以及用于获得双单倍体植物细胞的方法。在一些实施例中，该植物细胞选自下组，该组包括玉米、稻、番茄和烟草。还披露了将电磁场施加至植物细胞的装置。将电磁场施加至植物细胞的装置。将电磁场施加至植物细胞的装置。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通过施加电磁场使植物细胞染色体加倍
相关申请的交叉引用
[0001]本申请要求于2020年11月20日提交的美国临时申请号63/116,555的权益和优先权，该申请的全部披露内容出于所有目的通过引用并入本文。


[0002]本披露涉及制备双单倍体植物和双单倍体种子以便加速植物育种的方法、以及支持其的装置。

技术介绍

[0003]在现代植物育种计划中广泛使用双单倍体植物。典型地，这涉及获得作为正常植物与单倍体诱导植物之间杂交的产物的单倍体植物，或者经由小孢子(microspore)培养、花药培养、胚珠培养或子房培养将单倍体配子体培养成单倍体孢子体。单倍体植物孢子体缺乏某种形式的自发染色体加倍，如果在没有进一步人为干预的情况下使其发育，则是不育的，并且仅含有该植物物种的正常染色体数的一半。参见S.T.Chalyk,Properties of maternal haploid maize plants and potential application to maize breeding[玉米母本单倍体植物的特性以及在玉米育种中的潜在应用],Euphytica[荷兰植物育种杂志]79:13
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18(1994),在第14页,第2栏。例如，玉米被认为是包含20条染色体的二倍体生物(即，每组10条不同染色体的两个拷贝)。例如参见，M.P.Maguire,Chromosome behavior at premeiotic mitosis in maize[玉米中减数分裂前有丝分裂的染色体行为],J.Heredity[遗传学杂志]74:93
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96(1983),在表1。相比之下，单倍体玉米植物仅含有10条染色体(即，每组10条染色体的一个拷贝)。为了使单倍体植物可育，即使不是全株植物，至少在雄性和雌性生殖谱系中，必须使染色体组加倍。
[0004]种间杂交是现代和历史植物育种计划中广泛使用的技术。典型地，这涉及将来自不同物种或亚种的两种植物一起杂交，以产生具有两组不同染色体的杂种。在植物育种中，这种杂交经常用于将野生近缘种的性状基因掺入驯化作物物种中，或者将一种驯化物种的性状基因掺入另一种驯化物种中。植物育种的实例包括小麦与黑麦的种间杂种和芜菁(Brassica rapa)与甘蓝(Brassica oleracea)的种间杂种。由于染色体配对和减数分裂分离问题，种间杂种通常部分或完全不育。为了将种间杂种植物从不育转化为可育，将它们的染色体通过有丝分裂抑制来加倍，如下文所述。
[0005]植物染色体的加倍典型地使用液体有丝分裂纺锤体毒剂(有时用于治疗人类的癌症的有毒化学品，或者这些化学品可能是抗微管除草剂)来完成。参见Y.Wan等人,The use of antimicrotubule herbicides for the production of doubled haploid plants from anther
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derived maize callus[使用抗微管除草剂从花药来源的玉米愈伤组织产生双单倍体植物],Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]81(2):205
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211(1991)。可替代地，可以使用一氧化二氮气体来实现染色体加倍。抗有丝分裂化学品会干扰细胞组装微管和形成有丝分裂期间细胞分裂所必需的纺锤丝的能力。在癌症治疗的情况下，毒素用于干
扰有丝分裂一段时间，以便引起细胞死亡。参见Z.Y.Lin等人,Anticancer effects of clinically acceptable colchicine concentrations on human gastric cancer cell lines[临床上可接受的秋水仙碱浓度对人胃癌细胞系的抗癌作用],J.Med.Sci.[医学科学杂志]32(2):68
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73(2016)。细胞不能分裂；细胞死亡。对于植物，如果细胞暴露时间过长(称为“致死期”)，这些毒素也将引起细胞死亡。值得注意的是，如果施加毒素的时间短于致死期，DNA复制(即，细胞染色体加倍以预期细胞分裂)可以正常进行。因此，必须在施加毒素的时间足够长以最大化单倍体植物细胞染色体的加倍同时抑制有丝分裂，但又足够短以最小化细胞死亡之间取得谨慎的平衡。这可以被打趣地称为“浸泡与期待(soak and hope)”方法。
[0006]植物细胞是否可以维持毒素以及可以维持多长时间取决于植物物种、组织特异性、发育阶段以及毒素本身。秋水仙碱是用于植物的主要染色体加倍剂(“CDA”)；然而，其他已知的纺锤体毒剂包括氟乐灵、拿草特等。参见例如，A.M.Castillo等人,Chromosome Doubling in Monocots[单子叶植物中的染色体加倍],在第331
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332页,于Advances in Haploid Production in Higher Plants[高等植物单倍体产生的研究进展](A.Toureav等人编辑,2009)；和美国专利号8,859,846的表1，通过引用以其全文并入本文。在玉米和许多其他物种中，单倍体、二倍体和种间杂种的胚和幼苗能够在秋水仙碱的染色体加倍中存活下来，但是存活率明显低于100％，并且可育性往往保持很低，通常低于50％。换句话说，处理通常不是很有效。
[0007]将有毒的CDA施加至单倍体植物组织的“浸泡与期待”方法中存在多个挑战。首先，必须允许CDA有足够的时间渗透到靶标中，并且允许DNA复制的同时抑制有丝分裂。然后，必须在引起细胞死亡之前去除CDA。第二个挑战在于安全处理和正确处置CDA。因此，需要以更有效且危害性更低的方式干扰植物细胞中的有丝分裂，同时另外为实践加倍方法的人员创造更安全的环境。

技术实现思路

[0008]此
技术实现思路
是对本披露各个方面的高级概述，并且介绍了本文档和附图中所描述和说明的一些概念。此
技术实现思路
不旨在标识所要求保护的主题的关键或基本特征，也不旨在单独使用以确定所要求保护的主题的范围。应该通过参考整个说明书的适当部分、任何或全部附图以及每项权利要求来理解主题。下文讨论了本披露的一些示例性实施例。
[0009]本披露部分基于诸位专利技术人对通过施加电磁场(“EMF”)使植物细胞染色体加倍的方法的开发。诸位专利技术人已经认识到，当调谐到有效频率并且以足够的强度和/或足够的持续时间施加时，EMF可以破坏纺锤丝形成而不触发细胞死亡。当在有丝分裂期间施加EMF时，植物细胞会经历DNA复制，但不会成功完成有丝分裂。实际上，暴露于EMF的单倍体或种间植物细胞在不存在液体纺锤体毒剂的情况下将使其染色体加倍，并且不会遭受该毒剂的任何致命副作用。
[0010]在一个方面，本文提供了用于使植物细胞中的染色体加倍的方法，这些方法包括将EMF施加至植物细胞以及允许EMF破坏有丝分裂，其中该植物细胞复制其染色体而不经历细胞分裂，从而获得具有加倍染色体的植物细胞。在一些实施例中，EMF通过破坏纺锤丝本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种用于在植物细胞中进行染色体加倍的方法，所述方法包括：a)将电磁场(“EMF”)施加至植物细胞；以及b)允许所述EMF破坏有丝分裂；其中所述植物细胞复制其染色体而不经历细胞分裂，从而获得具有加倍染色体的植物细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其中所述EMF通过破坏纺锤丝形成来破坏有丝分裂。3.根据权利要求1所述的方法，其中所述EMF以有效频率和强度施加足够的施加持续时间以破坏所述植物细胞中的有丝分裂。4.根据权利要求1所述的方法，其中所述施加的EMF具有波形，并且其中所述施加的EMF的参数包括所述波形的频率、周期和振幅中的一项或多项。5.根据权利要求3所述的方法，其中所述有效频率在1kHz至300GHz的范围内，包括端值。6.根据权利要求3所述的方法，其中所述足够的施加持续时间选自由以下组成的组：(i)至少相当于所述植物细胞的有丝分裂前期的持续时间；(ii)相当于所述植物细胞的整个有丝分裂周期的持续时间；和(iii)约5小时。7.根据权利要求6所述的方法，其中对于玉米细胞，所述相当于有丝分裂前期的持续时间为大约25分钟。8.根据权利要求1所述的方法，其中所述植物细胞是单子叶植物或双子叶植物。9.根据权利要求8所述的方法，其中所述单子叶植物选自由以下组成的组：玉米、小麦、稻、高粱和大麦。10.根据权利要求8所述的方法，其中所述双子叶植物选自由以下组成的组：大豆、向日葵、番茄、烟草、瓜类蔬菜、芸苔、莴苣、矮牵牛、玫瑰、天竺葵和洋葱。11.根据权利要求1所述的方法，其中所述植物细胞是单倍体植物细胞。12.根据权利要求1所述的方法，其中所述植物细胞是分生组织细胞。13.根据权利要求1所述的方法，其中所述植物细胞是配子细胞。14.根据权利要求1所述的方法，其中所述植物细胞包含在组织样品中。15.根据权利要求14所述的方法，其中所述组织样品是植物胚。16.根据权利要求14所述的方法，其中所述组织样品选自由以下组成的组：花、雌穗、雄穗、种荚、种子、胚和任何前述项的一部分，条件是所述组织样品包含活细胞。17.一种染色体加倍植物细胞，所述染色体加倍植物细胞通过根据权利要求1所述的方法产生。18.根据权利要求17所述的染色体加倍植物细胞，其中所述染色体加倍植物细胞包含在植物胚中。19.一种植物，所述植物从根据权利要求17所述的染色体加倍植物细胞生长而来。20.一种根据权利要求19所述的植物的后代。21.一种用于将电磁场施加至植物细胞的装置，所述装置包括用于接收含有植物细胞的样品的空腔、用于从接收自电源的电力生成和放大电磁场的电路、用于将所述植物细胞在所述空腔中保持在适当位置的接受器、以及一对电极。22.根据权利要求21所述的装置，所述装置还包括：示波器，所述示波器用于测量施加
至所述植物细胞的EMF并且显示代表所测量的EMF的指示。23.根据权利要求21所述的装置，其中所述接受器包括所述电极对，并且其中所述电极对是彼此平行排列的第一对相对电极，其中在所述相对电极对之间的间隔限定用于保持所述植物细胞的所述空腔。24.根据权利要求23所述的装置，其中所述接受器包括绝缘电极。25.根据权利要求23所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：W，
申请(专利权)人：普渡研究基金会，
类型：发明
国别省市：