用于结核菌素效价标定的试剂盒、标定方法及其应用技术

本发明专利技术涉及药及动物病检测技术领域，具体而言，本发明专利技术涉及一种用于结核菌素效价标定的试剂盒，包括第一单克隆抗体包被的酶标板和酶标记的第二单克隆抗体，第一单克隆抗体为单克隆抗体1A2或单克隆抗体5G2，第二单克隆抗体为单克隆抗体1A2或单克隆抗体5G2。本发明专利技术的单克隆抗体的特异性好，为准确测定致敏豚鼠血液中IFN

【技术实现步骤摘要】
No.45344；
[0008]所述单克隆抗体5G2由杂交瘤细胞株GIFN
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5G2分泌，所述杂交瘤细胞株GIFN
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5G2于2023年1月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.45343；中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
[0009]作为上述技术方案的改进，所述第一单克隆抗体为单克隆抗体1A2，所述第二单克隆抗体为单克隆抗体5G2。
[0010]作为上述技术方案的改进，所述第二单克隆抗体通过HRP酶标记。
[0011]作为上述技术方案的改进，还包括标准品、封闭液、样品稀释液、酶标抗体稀释液、洗涤液、显色液和终止液。
[0012]作为上述技术方案的改进，所述封闭液为含有5wt％脱脂乳的PBS，所述样品稀释液为含有1wt％BSA的PBS，所述酶标抗体稀释液为含有1wt％BSA的PBST，所述洗涤液为PBST，所述显色液为TMB溶液，所述终止液为2M H2SO4溶液。
[0013]作为上述技术方案的改进，所述标准品为重组表达的豚鼠IFN
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γ。
[0014]作为上述技术方案的改进，所述结核菌素为牛结核菌素或禽结核菌素。
[0015]作为本专利技术的第二个方面，本专利技术提供了一种结核菌素效价标定的方法，其包括以下步骤：
[0016](1)制备单克隆抗体1A2和单克隆抗体5G2；
[0017](2)采用第一单克隆抗体包被酶标板，将第二单克隆抗体采用酶标记；其中，所述第一单克隆抗体为单克隆抗体1A2或单克隆抗体5G2，所述第二单克隆抗体为单克隆抗体1A2或单克隆抗体5G2；
[0018](3)在所述酶标板中加入待测样品，进行反应；
[0019](4)将酶标记的第二单克隆抗体加入酶标板，进行反应，反应后显色、终止；
[0020]所述单克隆抗体1A2由杂交瘤细胞株GIFN
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1A2分泌，所述杂交瘤细胞株GIFN
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1A2于2023年1月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.45344；
[0021]所述单克隆抗体5G2由杂交瘤细胞株GIFN
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5G2分泌，所述杂交瘤细胞株GIFN
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5G2于2023年1月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.45343；中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
[0022]作为本专利技术的第三个方面，本专利技术提供了上述的试剂盒在制备用于牛结核病检测的试剂盒中的应用。
[0023]作为本专利技术的第三个方面，本专利技术提供了上述的试剂盒在制备用于禽结核病检测的试剂盒中的应用。
[0024]实施本专利技术，具有如下有益效果：
[0025]本专利技术利用特异性高的单克隆抗体1A2和单克隆抗体5G2作为捕获抗体和检测抗体，其特异性好，为准确测定致敏豚鼠血液中IFN
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γ浓度提供了良好的基础。此外，本专利技术的标定方法标定效率高，准确性高，重复性强，检测成本低。
附图说明
[0026]图1为SDS
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PAGE检测纯化的重组豚鼠IFN
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γ蛋白图。泳道M：蛋白分子量标准；泳道1：纯化后的豚鼠IFN
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γ。
[0027]图2为SDS
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PAGE检测纯化的鼠抗豚鼠IFN
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γ单克隆抗体蛋白图。泳道M：蛋白分子量标准；泳道1：纯化后的1A2；泳道2：纯化后的3B5；泳道3：纯化后的3B7；泳道4：纯化后的5G2；泳道5：纯化后的4F7。
具体实施方式
[0028]为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面对本专利技术作进一步地详细描述。
[0029]实施例1重组豚鼠IFN
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γ的表达与纯化
[0030]1、重组质粒的构建及鉴定
[0031]利用Signal IP5.0在线分析GenBank中豚鼠IFN
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γ的碱基序列(AY151287)，去除1
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25氨基酸的信号肽序列，人工合成IFN
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γ基因片段(426bp)，其序列为(SEQ NO：1)：
[0032]agatttacaaatgaaatacgcattctaaagaactactttaatgcagataactcagatgtaggagacaatgggacgctctttgtaggcattttgaagaattgccaagaggagagtgaaagaaaaatatttcagagccaaatcgtctccttctacttcaaactctttgaaaaacattttacagacaatcagactgtccaaaatagcatgaacaccatcaaggaacaaattattactaagttcttcaaagacaacagcagcaacaaggtgcaggctttcaaaaacctgattcaaatttcggtcaatgacgagcatgtccagcgccaagcgatcattgaactcaaaaaagtgatagatgacctgtcaccgaaccagaggaaacgaagaaggactcagatgctgtttcagagccggagagcatccaaataa
[0033]以合成序列为模板，利用IFN
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F/R引物扩增豚鼠IFN
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γ基因片段作为模板进行PCR扩增。具体的，PCR反应体系为：
[0034][0035]PCR反应程序为：95℃预变性5min；95℃变性15s，55℃退火15s，72℃延伸30s，30个循环；72℃延伸5min，4℃保存。将PCR产物与10
×
loading buffer混合，进行琼脂糖凝胶电泳，115V，30min，紫外凝胶成像仪下观察条带，切胶条，用胶回收试剂盒(天根生物)回收目的条带。
[0036]表1豚鼠IFN
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γ基因序列引物
[0037][0038][0039]注：小写字母为酶切位点，斜体为Kozack序列。
[0040]用BamH I和Xba I双酶切pFastBacTM
‑
HTA质粒(购自Thermofisher公司，由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所保存)和回收的PCR产物。酶切体系如下：
[0041]1)酶切反应Ⅰ：
[0042][0043]充分混匀后置于金属恒温仪上，37℃温育2小时；反应结束后用胶回收试剂盒(天根生物)回收酶切产物。
[0044]2)酶切反应Ⅱ：
[0045][0046]充分混匀后置于金属恒温仪上，37℃温育2小时；反应结束后用胶回收试剂盒(天根生物)按照操作说明回收酶切产物。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于结核菌素效价标定的试剂盒，其特征在于，包括：第一单克隆抗体包被的酶标板和酶标记的第二单克隆抗体，所述第一单克隆抗体为单克隆抗体1A2或单克隆抗体5G2，所述第二单克隆抗体为单克隆抗体1A2或单克隆抗体5G2；所述单克隆抗体1A2由杂交瘤细胞株GIFN
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1A2分泌，所述杂交瘤细胞株GIFN
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1A2于2023年1月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.45344；所述单克隆抗体5G2由杂交瘤细胞株GIFN
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5G2分泌，所述杂交瘤细胞株GIFN
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5G2于2023年1月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.45343；中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第一单克隆抗体为单克隆抗体1A2，所述第二单克隆抗体为单克隆抗体5G2。3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第二单克隆抗体通过HRP酶标记。4.如权利要求1至3任一项所述的试剂盒，其特征在于，还包括标准品、封闭液、样品稀释液、酶标抗体稀释液、洗涤液、显色液和终止液。5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述封闭液为含有5wt％脱脂乳的PBS，所述样品稀释液为含有1wt％BSA的PBS，所述酶标抗体稀释液为含有1wt％BSA的PBST，所述洗涤液为PBST，所述显色液为TMB溶液，所述终止液为2...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁家波，鑫婷，张广智，范学政，蒋卉，沈青春，梁琳，吕浪，
申请(专利权)人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：