【技术实现步骤摘要】
一种拟穴青蟹精原干细胞的体外培养方法
[0001]本专利技术涉及细胞工程领域,具体涉及一种拟穴青蟹精原干细胞的体外培养方法。
技术介绍
[0002]细胞培养技术也叫细胞克隆技术,细胞培养用于细胞遗传学、生化和分子实验室的研究以及毒理学研究。
[0003]通过人为的控制细胞培养条件,能够研究细胞代谢、物理、化学、生物因素的影响。细胞培养相较于动物实验耗资少、经济成本低,可大量培养,可利于生物制品的生产。目前已有非常多的细胞系建立成功,包括人类及模式动物的正常细胞、干细胞、肿瘤细胞和缺陷细胞等,但甲壳动物细胞培养依旧困难重重。迄今为止,还未见甲壳动物细胞培养技术应用的稳定方法的报道,更没有应用甲壳动物细胞进行细胞水平相关实验的报道。
[0004]甲壳动物细胞对外界环境生长条件非常敏感,目前,所能购买的商用培养基均为基础培养及和其他物种的特定培养基,仅使用基础培养基不足以满足甲壳动物细胞在体外的正常生存所需。在现有关于初步尝试甲壳动物细胞培养的报道中,无论是使用TC199、M199还是L
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15及其他培养基都不能够使细胞长期保持活性,细胞增殖速率远远低于死亡率,更无法进行传代培养。因此,细胞培养技术在甲壳动物中一直未有突破性的进展。
[0005]精原干细胞(Spermatogonial stem cells,SSCs)是精子发生的基础,对生物的遗传信息传递至关重要。甲壳动物的精原干细胞都具有高度的自我更新和分化能力,在合适的培养条件下,具有形成拟胚体的能力,并具有分化为多种类型体细 ...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种拟穴青蟹精原干细胞的体外培养方法,其特征在于,包括如下步骤:A、制备培养基,保存备用;B、在离心管中加入所述培养基,备用;C、在培养皿或孔板的培养孔中加入所述培养基,备用;D、取组织放入所述离心管中,剪碎所述组织,再吹打所述组织,之后将所述离心管插入冰中静置,之后轻轻吸弃上清,吹打混匀细胞并计数,将一定数量细胞的悬液转移到所述培养皿或所述孔板的培养孔中;E、将所述培养皿或所述孔板的培养孔移入培养箱中培养,之后沿所述培养皿或所述孔板的培养孔边缘缓慢吸弃旧的上层所述培养基,加入适量相应新的所述培养基,勿使细胞漂起,移入所述培养箱中继续培养;F、定时换液,换液时缓慢吸弃旧的所述培养基原液,加入新的所述培养基;G、待原代细胞长满所述培养皿或所述孔板的培养孔底后,进行传代或进一步筛选。2.如权利要求1所述拟穴青蟹精原干细胞的体外培养方法,其特征在于,步骤A中,所述培养基包括如下组分:DMEM高糖培养基为基础培养基,添加胎牛血清、拟穴青蟹血清、青霉素
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链霉素
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两性霉素B混合抗生素、L
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谷氨酸、非必要氨基酸、丙酮酸、碱性成纤维细胞生长因子和β
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巯基乙醇;所述拟穴青蟹血清的制备方法为:在拟穴青蟹身上抽血,与抗凝剂混匀、离心,收集上清,过滤除菌后获得所述拟穴青蟹血清。3.如权利要求2所述拟穴青蟹精原干细胞的体外培养方法,其特征在于,步骤A中,所述培养基的配置为:每升基础培养基中添加200mL胎牛血清、20mL拟穴青蟹血清、10mL青霉素
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链霉素
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两性霉素B混合抗生素、2mL L
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谷氨酸、4mL非必要氨基酸、2mL丙酮酸钠、200ng碱性成纤维细胞生长因子和10mLβ
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巯基乙醇;所述拟穴青蟹血清的制备方法为:在拟穴青蟹成蟹关节膜处抽血,之后与等体积的所述抗凝剂混匀,4℃下2000
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g离心20min,收集上清,使用0.22μm滤膜过滤除菌,获得所述拟穴青蟹血清。4.如权利要求1所述拟穴青蟹精原干细胞的体外培养方法,其特征在于,步骤A中,所述培养基制备完成后,低温保存备用;步骤B中,所述离心管插入冰中备用;步骤C中,所述孔板为6孔板;步骤D中,使用眼科剪剪碎所述组织,再使用移液枪吹打所述组织,之后...
【专利技术属性】
技术研发人员:李升康,宋莹,云琳颖,张明,梁惠芬,林海天,
申请(专利权)人:汕头大学,
类型:发明
国别省市:
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