修饰响应碱性磷酸酶荧光分子的金纳米颗粒探针及制备方法技术

修饰响应碱性磷酸酶荧光分子的金纳米颗粒探针及制备方法，属于探针技术领域。所述探针为hCy

【技术实现步骤摘要】
修饰响应碱性磷酸酶荧光分子的金纳米颗粒探针及制备方法


[0001]本专利技术是一种诊断型的荧光分子
‑
金纳米颗粒复合探针，涉及一种修饰响应碱性磷酸酶荧光分子的金纳米颗粒探针的制备方法，通过细胞水平以及动物水平的近红外荧光成像，来验证该探针响应碱性磷酸酶以及延长肿瘤成像窗口的能力。

技术介绍

[0002]金纳米颗粒又称为胶体金，是氯金酸(HAuCl4)在白磷、抗坏血酸、柠檬酸钠、鞣酸等还原剂的还原下，金原子逐渐聚集变成的小尺寸的纳米颗粒。金纳米颗粒通常是一种金的胶体悬浮液，粒径为1
‑
100nm不等，颜色呈现出橙黄色到紫红色不等。还原性配体与金的结合常与Au
‑
S键键合有关，由于金与巯基(
‑
SH)形成稳定的Au
‑
S键，产生了极为稳定的化学键，故而形成了性质稳定的胶体。金纳米颗粒在水溶液、碱性环境下常带负电荷，可与正电荷基团(例如蛋白质、多肽)形成牢固的结合，而且不影响蛋白质的生物特性。金纳米颗粒除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA等。金纳米颗粒的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，使金纳米颗粒广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。
[0003]碱性磷酸酶简称ALP，是一类广泛分布于肝、肾、肠、骨骼当中的一类磷酸水解酶。这种酶能催化核酸分子脱掉5
’
端磷酸基团，从而使DNA或RNA片段的5
>’‑
P末端转换成5
’‑
OH末端，也可以催化带有磷酸基团的有机化合物，而ALP的过表达往往与重大疾病如肝硬化、肝细胞癌、胆管疾病、病毒性肝炎、酒精性肝炎、药物性肝损害以及其他恶性肿瘤有关，因此基于ALP设计的探针被广泛应用于医学诊断当中。ALP的含量在青少年时期较高，最高可至0.75U/mL，而在正常成人人体中，ALP的含量在0.04
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0.15U/mL之间，若远远高于此指标则代表机体的不正常情况。因此，对ALP含量的研究可以用来诊断相关疾病，开发一种检测活体内ALP含量的有效方法具有较高的医学前景。
[0004]小分子荧光探针是一类靠激发光给予能量，由基态转移至激发态释放能量发射荧光的分子器件。理化性质(激发和发射波长、紫外光谱、寿命等)可随所处环境的性质(极性、折射率、粘度等)改变而灵敏地改变的一类荧光性分子。其中在生物成像中应用最广泛的是近红外荧光探针。常用的近红外荧光团有罗丹明类、花菁类、BODIPY类、卟啉类等，这些荧光团会在近红外(NIR)区域(700
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1700nm)发出荧光，近红外光利于穿透深层组织，使透过生物样品的光损失小，背景干扰小，这是近红外荧光探针在生物体内成像的一个非常有利的特性。
[0005]为了解决两个模块(荧光团与反应位点、药物分子之间、药物分子与DNA)如何相连的问题，科学家Sharpless发现了一种生物正交Click点击反应。其本质是将两个分子的一端各修饰上可以反应联结的端头，使用适当的催化剂可以使得端头之间相连，达到两个分子之间缀连的效果，并且反应快速、有效、利用率高。其分类基本包括叠氮
‑
炔基反应、烯
‑
硫醇反应、叠氮
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氨基反应。这种反应最大的优点就是模块化、产率高、环境无污染、反应条件简单，适应于各种生物蛋白、药物、DNA等的缀连反应。Click反应的出现使得两个模块之间
的连接变得简单、易行，也使得生物正交反应在生命科学的应用展示了广阔前景。
[0006]本专利技术涉及一种半花菁染料荧光分子IR700和巯基
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聚乙二醇
‑
二苯基环辛炔(DBCO
‑
PEG
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SH)通过生物点击反应合成的小分子，再通过Au
‑
S键修饰到金纳米颗粒上的制备方法。首先将金氯酸通过还原法使柠檬酸盐与Au原子表面缀连，生成柠檬酸盐保护的金纳米颗粒。再将半花菁类染料IR700与ALP酶识别位点相连，使得荧光分子具有识别肿瘤内过表达标志物ALP酶的能力，使得荧光分子在肿瘤部位蓄积。接着，将荧光分子与DBCO
‑
PEG
‑
SH使用生物点击反应稳定相连，合成探针的表面配体。最后用配体交换法，依靠荧光分子上巯基的强亲和能力，取代柠檬酸盐与金颗粒结合，并修饰完成。由于枝接的金纳米颗粒在实体瘤的高滞留(EPR)效应，可以增强其在肿瘤部位的蓄积效果，提高成像的窗口时间，达到长滞留成像的目的。本专利技术在递药载体及生物成像、医药等领域具有重要的应用价值。

技术实现思路

[0007]本专利技术的修饰响应碱性磷酸酶荧光分子的金纳米颗粒探针即hCy
‑
ALP@AuNPs，hCy
‑
ALP@AuNPs的结构如下：
[0008][0009]所述hCy
‑
ALP@AuNPs的制备方法具体包括以下步骤：
[0010](1)化合物5的制备，包括以下步骤：(a)在氮气保护下，将2,3,3
‑
三甲基吲哚即化合物1、碘化钾以及1
‑
叠氮
‑4‑
氯
‑
丁烷溶解在无水乙腈中，并将反应液加热至90℃回流9小时，石油醚重结晶，获得紫色化合物2；(b)将化合物2、2
‑
氯
‑3‑
(羟基亚甲基)环己
‑1‑
烯甲醛和甲醇钠溶解在无水乙酸酐中，并将反应液加热至130℃回流3小时，石油醚重结晶，获得绿色化合物3；(c)将化合物3与间二苯酚、三乙胺溶解在无水乙腈中，并将反应液加热至50℃反应6小时，通过柱层析法纯化(甲醇：二氯甲烷＝1:50
‑
1：10)得到蓝绿色化合物4；(d)将化合物4和三氯氧磷溶解在一定体积无水吡啶中，并将反应液室温反应如12小时，再加入相同体积冰水室温反应如12小时，反应后乙酸乙酯与水萃取，去除有机相留取水相，冻干后通过高效液相色谱仪分离，获得蓝色化合物5。
[0011][0012](2)化合物6的制备方法，包括如下步骤：将化合物5溶于二甲基亚砜，并与巯基
‑
聚
乙二醇
‑
二苯基环辛炔一起加入至少9倍体积水中混合，在水中进行Click反应1
‑
3小时，得到化合物6。
[0013][0014](3)金纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：根据文献制备方法，在提前用王水泡过的圆底烧瓶中加入氯金酸，加热至95℃，逐滴加入大量的柠檬酸钠，同时保持高速搅拌，反应35分钟，待金胶体形成完毕，获得柠檬酸钠保护的金颗粒，呈紫红色，透射电镜下观察粒径为20nm左右。
[0015][0016](4)hCy
‑
ALP@AuNPs的制备方法，包括以下步骤：将柠檬酸钠保护的金颗粒与化合物6进行配体本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.修饰响应碱性磷酸酶荧光分子的金纳米颗粒探针
，
其特征在于，为hCy
‑
ALP@AuNPs，hCy
‑
ALP@AuNPs的结构如下：2.权利要求1所述的修饰响应碱性磷酸酶荧光分子的金纳米颗粒探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)化合物5的制备，包括以下步骤：(a)在氮气保护下，将2,3,3
‑
三甲基吲哚即化合物1、碘化钾以及1
‑
叠氮
‑4‑
氯
‑
丁烷溶解在无水乙腈中，并将反应液加热回流，石油醚重结晶，获得紫色化合物2；(b)将化合物2、2
‑
氯
‑3‑
(羟基亚甲基)环己
‑1‑
烯甲醛和甲醇钠溶解在无水乙酸酐中，并将反应液加热回流，石油醚重结晶，获得绿色化合物3；(c)将化合物3与间二苯酚、三乙胺溶解在无水乙腈中，并将反应液加热反应，通过柱层析法纯化得到蓝绿色化合物4；(d)将化合物4和三氯氧磷溶解在无水吡啶中，并将反应液室温反应，再加入相同体积冰水室温反应，反应后乙酸乙酯与水萃取，去除有机相留取水相，冻干后通过高效液相色谱仪分离，获得蓝色化合物5；(2)化合物6的制备方法，包括如下步骤：将化合物5溶于二甲基亚砜，并与巯基
‑
聚乙二醇
‑
二苯基环辛炔一起加入至少9倍体积水中混合，在水中进行Click反应，得到化合物6；(3)金纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：根据文献制备方法，在提前用王水泡过的圆底烧瓶中加入氯金酸，加热，逐滴加入大量的柠檬酸钠，同时保持高速搅拌，反应，待金胶体形成完毕，获得柠檬酸钠保护的金颗粒；(4)hCy
‑
ALP@AuNPs的制备方法，包括以下步骤：将柠檬酸钠保护的金颗粒与化合物6进

【专利技术属性】
技术研发人员：苏冬冬，王亚玲，李明睿，
申请(专利权)人：北京工业大学，
类型：发明
国别省市：