一种复方葛根芩连汤及其方法与作用技术

本发明专利技术公开了一种复方葛根芩连汤及其方法与作用，1)建立非酒精性脂肪肝病小鼠模型，2)复方葛根芩连汤治疗非酒精性脂肪性肝病宏基因组与代谢组学分析，3)复方葛根芩连汤使用后经肠道菌群代谢物3

【技术实现步骤摘要】
一种复方葛根芩连汤及其方法与作用


[0001]本专利技术涉及领域药物
，尤其涉及一种复方葛根芩连汤及其方法与作用。

技术介绍

[0002]非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)是由糖脂代谢紊乱诱发的以肝细胞脂质沉积为特征的肝脏疾病,现已成为全球最常见的慢性肝病，累及全球约25％的人口。NAFLD可进展为非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)、肝纤维化和肝硬化，甚至肝细胞癌，且与2型糖尿病、动脉硬化等代谢性疾病高发密切相关。NAFLD病人数量庞大，未来10年将成为肝移植的主要病因，但至今还没有任何权威机构批准的药物上市，主要是由于其复杂的发病机制、疾病异质性等原因所致。
[0003]经典的“二次打击”学说可以部分解释NAFLD的发病机制，第一次打击主要是胰岛素抵抗形成的大量游离脂肪酸(FFA)进入肝脏并在肝脏内进行代谢，超过线粒体β氧化负荷时,多余的FFA转化为甘油三酯并在肝脏细胞内堆积；第二次打击主要是脂质过量沉积的肝细胞发生脂质过氧化和氧化应激，导致线粒体功能障碍、炎症介质产生、肝星状细胞激活，从而导致NASH和纤维化的发生。近年来，随着新的研究结果的不断出现，提出了“多重平行打击”理论：在NAFLD的发病过程中，胰岛素抵抗、脂毒性、肠道菌群、脂肪因子、肝脏因子、胆汁酸、遗传多态性和表观遗传学等多重打击同时发挥作用，尤其是肠源性和脂肪组织源性因子可能起着核心作用。
[0004]近年来，基于各种新理论和新靶点的NASH新药陆续进入临床试验，在研的作用于疾病不同阶段的药物有近200种，临床研究中也看到了降低肝脏脂肪、改善肝脏炎症，甚至肝纤维化的效果。然而，人们似乎还是低估了NASH发病机制的复杂性，NASH新药研发并没有达到人们所预期的。基于NASH是一种多因素疾病，涉及到不同的发病机制，根据不同的作用靶点采用多种药物联合治疗成为一种新的策略。中药方剂可通过多种有效组分对机体进行多系统、多途径、多靶点的综合调节与治疗，具有整体观念、辨证论治、因人施治、复方用药等诊疗优势和特色，在一定程度上与NAFLD复杂的病机相契合，这使得其在NAFLD的治疗中发挥优势。
[0005]由于至今尚未有批准用于治疗NAFLD的药物，使得中医药在NAFLD的临床应用中较为普遍，特别在改善临床症状、保肝降酶等多方面显示出一定的综合治疗优势。中医学典籍中并无脂肪性肝病的记载，但根据其临床表现，可归属于“肝癖”、“胁痛”、“积聚”等范畴。饮食不节、劳逸失度、情志失调、久病体虚、禀赋不足是其主要病因。饮食不节、劳逸失度、伤及脾胃、或情志失调、肝气郁结、肝气乘脾、或久病脾胃虚弱，脾失健运，湿浊内生；湿邪日久，郁而化热，而出现湿热内蕴；久病及肾，肾精亏损，气化失司，痰浊不化，痰浊内结，阻滞气机，气滞血瘀，瘀血阻络，终致痰瘀互结。健脾化湿，化瘀祛痰为其基本治则。
[0006]复方葛根芩连汤由葛根、黄芩、黄连、甘草六味中药组成；方中葛根具有解表药物退热、升阳脾胃清阳之气为君药；臣药为黄连、黄芩清热利湿，辅药甘草。近来的实验研究表
明复方葛根芩连汤可通过调节肠道菌群以改善糖尿病大鼠模型的血糖水平，但具体调控机制仍未阐明。
[0007]中药制剂往往以口服形式给药，中草药与肠道菌群密切相互作用并影响其组成，中药成分口服后往往不是直接被宿主吸收，而是进入肠道，被肠道菌群转化。特异性微生物特征和经转化的中药代谢物，可能有助于控制NAFLD发展的进程。肠道微生物群同时将中草药中的碳水化合物、蛋白质、脂类和非营养性小化合物转化为代谢物发挥重要作用，这些代谢物可能对人体健康产生有利或不利的影响，提示调节肠道微生物组成可能会提高中药治疗疾病疗效。
[0008]结合以上目前复方葛根芩连汤抗非酒精性脂肪性肝病疗效及其机制仍未阐明，因其复方多成分、多靶点复杂性。

技术实现思路

[0009]本专利技术提供一种复方葛根芩连汤及其方法与作用。
[0010]本专利技术的方案是：
[0011]一种复方葛根芩连汤，包括下列原料：垂盆草、茵陈、葛根、黄芩、黄连与甘草，所述垂盆草、茵陈、葛根、黄芩、黄连与甘草按质量比为8～12:8～12：3～7:1～5：1～5:1～4。
[0012]作为优选的技术方案，所述垂盆草、茵陈、葛根、黄芩、黄连与甘草按质量比为10:10：5:3：3:2。
[0013]一种基于肠道菌群研究复方葛根芩连汤在非酒精性脂肪肝病的方法，包括下列步骤：
[0014]1)建立非酒精性脂肪肝病小鼠模型，并对其进行样本采集；制备复方葛根芩连汤，按照垂盆草、茵陈、葛根、黄芩、黄连与甘草质量比为10:10：5:3：3:2称取，煎煮，浓缩，离心取上清液；葡萄糖耐量试验；肠道通透性检测；组织脱水包埋；HE染色；天狼星红染色；免疫组化；RNA抽提；逆转录及RT
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PCR；蛋白样品制备；BCA蛋白定量；蛋白变性；蛋白质印迹法；统计学统计分析；
[0015]2)复方葛根芩连汤治疗非酒精性脂肪性肝病宏基因组与代谢组学分析，肠道菌群样本及检测；血清及粪便代谢组学分析；生物信息学分析；
[0016]3)复方葛根芩连汤使用后经肠道菌群代谢物3
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苯丙酸通过TGR5调控改善非酒精性脂肪性肝病脂质紊乱，然后进行肝癌细胞系脂质沉积模型构建；3
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苯丙酸对肝癌细胞系脂质沉积模型中TGR5干扰与慢病毒感染处理后油红染色；3
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苯丙酸对肝癌细胞系脂质沉积模型中TGR5干扰与慢病毒感染处理后炎症及脂质合成蛋白表达情况；
[0017]4)细菌外囊泡可定位于肝脏并对非酒精性脂肪性肝病发挥生物学效应验证，肝组织、结肠组织16s rRNA与CD81共定位；肠道菌群中AKK细菌培养及外囊泡分离；体外成像。
[0018]作为优选的技术方案，所述生物信息分析包括下列步骤：
[0019]1)去低质量与去宿主得到clean read；
[0020]2)去除宿主小鼠基因污染；
[0021]3)kraken2使用数据库，从clean read中进行kraken2物种注释与bracken重新估算各样本物种丰度；
[0022]4)合并样本计算丰度信息，使用软件，生物信息学绘制R包。
[0023]作为优选的技术方案，所述步骤3)中肝癌细胞系脂质沉积模型构建方法包括下列步骤：
[0024]S1、质粒纯化；S2、质粒提取；S3、293T包装慢病毒；S4、病毒浓缩；S5、病毒感染；S6、siRNA转染；S7，构建肝癌细胞系脂质沉积模型。
[0025]作为优选的技术方案，所述siRNA转染的方法：
[0026]1)第一天于6孔板中接种Hepg2细胞，接种密度为第二天转染时细胞融合69～72％；
[0027]2)A管包括50nm siRNA与245ul Opti
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MEM；B管包括Lipo本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种复方葛根芩连汤，其特征在于，包括下列原料：垂盆草、茵陈、葛根、黄芩、黄连与甘草，所述垂盆草、茵陈、葛根、黄芩、黄连与甘草按质量比为8～12:8～12：3～7:1～5：1～5:1～4。2.一种基于肠道菌群研究如权利要求1所述的复方葛根芩连汤在非酒精性脂肪肝病的方法，其特征在于，包括下列步骤：1)建立非酒精性脂肪肝病小鼠模型，并对其进行样本采集；制备复方葛根芩连汤，按照垂盆草、茵陈、葛根、黄芩、黄连与甘草质量比为10:10：5:3：3:2称取，煎煮，浓缩，离心取上清液；葡萄糖耐量试验；肠道通透性检测；组织脱水包埋；HE染色；天狼星红染色；免疫组化；RNA抽提；逆转录及RT
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PCR；蛋白样品制备；BCA蛋白定量；蛋白变性；蛋白质印迹法；统计学统计分析；2)复方葛根芩连汤治疗非酒精性脂肪性肝病宏基因组与代谢组学分析，肠道菌群样本及检测；血清及粪便代谢组学分析；生物信息学分析；3)复方葛根芩连汤使用后经肠道菌群代谢物3
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苯丙酸通过TGR5调控改善非酒精性脂肪性肝病脂质紊乱，然后进行肝癌细胞系脂质沉积模型构建；3
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苯丙酸对肝癌细胞系脂质沉积模型中TGR5干扰与慢病毒感染处理后油红染色；3
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苯丙酸对肝癌细胞系脂质沉积模型中TGR5干扰与慢病毒感染处理后炎症及脂质合成蛋白表达情况；4)细菌外囊泡可定位于肝脏并对非酒精性脂肪性肝病发挥生物学效应验证，肝组织、结肠组织16s rRNA与CD81共定位；肠道菌群中嗜黏蛋白阿克曼菌培养及外囊泡分离；体外成像。3.如权利要求2所述的一种基于肠道菌群研究复方葛根芩连汤在非酒精性脂肪肝病的方法，其特征在于，所述生物信息分析包括下列步骤：1)去低质量与去宿主得到clean read；2)去除宿主小鼠基因污染；3)kraken2使用数据库，从clean read中进行kraken2物种注释与bracken重新估算各样本物种丰度；4)合并样本计算丰度信息，使用软件，生物信息学绘制R包。4.如权利要求2所述的一种基于肠道菌群研究复方葛根芩连汤在非酒精性脂肪肝病的方法，其特征在于，所述步骤3)中肝癌细胞系脂质沉积模型构建方法包括下列步骤：S1、质粒纯化；S2、质粒提取；S3、293T包装慢病毒；S4、病毒浓缩；S5、病毒感染；S6、siRNA转染；S7，构建肝癌细胞系脂...

【专利技术属性】
技术研发人员：施军平，宋育，
申请(专利权)人：杭州师范大学附属医院，
类型：发明
国别省市：