一种通过多基因转化提高甜菜耐盐耐旱性和抗除草剂绿黄隆特性的方法及应用技术

本发明专利技术公开一种通过多基因转化提高甜菜耐盐耐旱性和抗除草剂绿黄隆特性的方法及应用，是将来自植物的液泡膜钠氢反向转运蛋白基因ＮＨＸ１和液泡膜焦磷酸酶基因ＰＰａｓｅ、来自大肠杆菌的胆碱脱氢酶基因ｂｅｔＡ和来自拟南芥的抗除草剂绿黄隆的突变的乙酰乳酸合成酶基因ａｌｓ重组到植物表达载体中，转入甜菜细胞并高效表达，获得转基因植株；从转基因植株及其后代中筛选出耐盐耐旱性明显提高兼有绿黄隆抗性的转基因植株；通过对转基因植株细胞进行二次转化或使带有不同转基因的植株相互交配获得带有３－４个目标基因的转基因植株；从多基因转化植株后代中选择耐盐耐旱性优异兼抗除草剂绿黄隆的的个体，进而创建出耐盐耐旱兼抗除草剂绿黄隆的甜菜育种新材料。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术属农作物的生物工程育种领域，具体说，涉及一种通过多基因转化提高甜菜耐盐耐旱性和抗除草剂绿黄隆特性的方法及应用。
技术介绍
诸自然逆境中，干旱对世界作物产量的影响占居首位，其危害相当于其它自然灾害之和。盐渍化也是影响作物产量的主要环境因素。我国约二分之一国土面积处干旱、半干旱区。即使在非干旱地区的主要农业区，也不时受到旱灾侵袭。在我国16亿亩耕地中，盐碱地有1亿多亩，中低产田约10亿亩。其中大部分中低产田也是由于干旱和盐碱所致。此外有3亿亩盐碱荒地有待开发利用；灌溉地区次生盐渍化田地还在逐年增加。土壤盐渍化造成甜菜播种面积减小和产量锐减，农民急需耐盐高产甜菜品种。随着我国淡水资源的逐年匮乏和气候变暖，采用转基因技术培育耐盐耐旱甜菜具有重要的战略意义。干旱和盐碱构成了对植物的渗透胁迫，导致植物缺水和脂质过氧化，引起细胞结构严重受损和正常代谢活动不能进行。盐胁迫还引起离子毒害效应。植物的耐盐性和耐旱性既相互关联又存在差异，分别是由多基因控制的复杂性状，涉及到多条代谢途径，其中部分基因在进化上高度保守。近年来植物耐盐机理的研究取得了突破性进展，已从不同生物中克隆出一批耐盐相关基因，其中一些基因转入植物后能明显提高植株耐盐性。植物耐旱基因鉴定及定位研究也取得较大进展。采用基因工程技术提高作物耐盐耐旱性的研究目前集中在四个方面1)渗透保护与渗透调节，2)氧自由基的消除，3)离子均衡的调控，4)胞内信号传递通道的调节。离子均衡的调控机制又可分为抑制Na+的吸收；向胞外排出Na+；维持细胞K+营养；将胞质中有害Na+泵入并储存在液泡中，实现区域化分布。作物一般都具有或大或小的渗透调节功能，以适应环境中渗透压的变化。这种功能包括细胞中的渗透调节物(脯氨酸、甜菜碱、多羟基醇类等)的积累、膜通透性的变化等。在干旱和盐胁迫下，一些植物细胞内积累甘氨酸甜菜碱类物质以维持细胞的正常膨压和减轻离子毒害。甘氨酸甜菜碱合成酶基因的高强度表达及甜菜碱积累可大幅度提高植物的耐盐耐旱性。近年的一些研究表明，一些编码渗透调节剂合成酶的基因导入到植物后能使细胞内的渗透调节剂浓度提高，使植株对胁迫表现出更好的抗性。但渗透调节剂提高的浓度均很小，不会产生明显的渗透调节作用，推测是渗透调节剂保护了细胞结构和酶活性所致。将betA基因转入烟草(Lilius等)、将BADH(甜菜醛脱氢酶)基因转入草莓和烟草(陈受宜等)，植株的耐盐性均明显提高。糖类合成酶如甘露醇合成酶基因转入烟草等植物提高了植株的耐盐性(Tarczynski等，Liu等，Shen等)，海藻糖合成酶基因转入烟草提高了植株的耐旱性(Pilon-Smits等)。在复杂机制控制下的多条途径参与了细胞质中Na+浓度的调节。多数盐生植物消除Na+毒害的主要机制是将吸收的Na+定位于液泡来降低胞质中Na+的浓度，即离子区域化机制尤为重要。在甜土植物中，部分物种缺乏Na+/H+反向转运蛋白活性，部分物种Na+/H+反向转运蛋白活性低。因此，通过遗传改良使甜土植物在液泡中积累大量Na+已成为植物耐盐基因工程的策略。NHX1基因编码拟南芥等植物液泡膜上的Na+/H+反向转运蛋白。该蛋白是细胞内离子区域化的关键酶。将带有强启动子的AtNHX1基因转入拟南芥(Apes等)和番茄(Zhang等)中实现过量表达，获得了耐盐性大幅度提高的植株。采用转基因技术提高植物耐盐耐旱性是国内外研究的热点课题，已有大量的工作。将维持细胞内离子平衡的基因、合成渗透保护物质的基因、能减轻细胞内自由基危害的基因等导入植物，提高了植物的耐盐耐旱性，为培育耐盐耐旱作物新品种开辟了一条有效途径。但多数工作是以模式植物为材料进行的，只有转AtNHX1基因的耐盐番茄和油菜具有良好的应用价值。从策略和技术上讲，采用转基因技术提高作物耐盐耐旱性已具有成熟的技术路线和必要的实施条件。喷施除草剂已成为降低甜菜生产成本的重要措施，但适合甜菜田使用的选择性除草剂种类少。单一品种长期使用导致抗性杂草产生。因此，培育出抗除草剂的甜菜品种可增加甜菜地使用的高效无毒除草剂品种。als基因来源于拟南芥菜，根据已报道序列(Muzar BJ et al，1987；Haughn GW et al，1988)通过PCR扩增及定点突变技术获得197位脯氨酸改变为缬氨酸的突变基因。als基因是结构基因，编码乙酰乳酸合成酶(acetolactate synthase)。该酶是分支氨基酸合成途径中的第一个关键酶，除草剂绿黄隆能有效的抑制该酶活性，使植物因缺乏分支氨基酸而死亡。人类和哺乳类动物因缺乏乙酰乳酸合成酶而不受绿黄隆影响。本专利技术所用的基因为突变型(197位脯氨酸改变为缬氨酸)，编码的乙酰乳酸合成酶对绿黄隆抑制作用不敏感，因此，赋予转基因植物绿黄隆抗性。该基因长3250bp，编码399个氨基酸。由于绿黄隆是一种低(无)毒高效广谱性除草剂，不污染环境，抗绿黄隆甜菜品种的培育成功，可使绿黄隆在甜菜地安全使用，产生巨大的经济效益和社会效益。抗绿黄隆甜菜的推广，还可通过不同除草剂的交替使用来防止抗除草剂杂草的产生。甜菜是二年生异花授粉作物。在其生活的第一年，主要是进行营养生长，生长繁茂的叶丛和肥大的块根，并在根中积累营养物质。在生活的第二年，以生殖生长为主，由根头上生出花枝，在花枝上形成花器官，经过异花授粉和受精形成聚花果，即种球。甜菜具有耐旱、耐寒、耐盐碱等特点，适应性广，抗逆性强。它的一些野生种起源于海滨，抗逆性强。甜菜是重要的制糖原料，世界上约40％的糖来源于甜菜。除制糖外，甜菜还有很高的经济价值。甜菜制糖的副产品可以搞综合加工。甜菜的茎叶、青头、根尾、甜菜制糖废丝，都含有丰富的营养物质，可酿酒，也是牲畜的好饲料。畜牧业的发展和盐碱地的开发利用需要耐盐耐旱的甜菜品种。由于育种周期长和抗性检测较复杂等原因，采用常规育种技术至今未培育出适合滨海盐碱地种植或用淡海水灌溉的品种。如果能培育出耐盐性强的饲用甜菜新品种，不仅可充分开发利用滨海盐碱地，推动养殖业的发展，而且能有效改善生态环境。迄今国内外未报道获得耐盐或/和耐旱性显著提高且抗除草剂绿黄隆的具有实用价值的转基因甜菜。甜菜转基因研究工作在国内外均受到重视，已经有一些成功的报道。用于甜菜遗传转化的方法主要有农杆菌介导法和基因枪轰击法。与其它许多双子叶植物相比，甜菜的遗传转化相对较难，主要是转化细胞再生植株的频率很低。尽管甜菜细胞对农杆菌感染敏感，易于被农杆菌所转化，但转化后植株再生率低，且受基因型限制，因而主要工作集中在转化方法的改进、抗病、抗除草剂]等方面。1991年，Fry等以甜菜子叶为外植体，利用根瘤农杆菌介导法，将抗除草剂基因转入甜菜，以草甘膦为选择剂进行筛选，最终获得抗草甘膦的转基因甜菜，但频率很低。1992年，Halluin等以胚产生的愈伤组织为受体，将抗除草剂基因转入甜菜，获得了抗除草剂的转基因植株。1997年，Marie等将epsps gos nptII导入甜菜，结果证实不同转化株间对草甘膦抗性存在差异。2000年，Dewar等论述了抗除草剂转基因甜菜的种植情况。他们将抗除草剂的转基因甜菜植株栽入大田，开花后收集花粉与其它遗传性状好的株系回交几代，得到了抗除草剂的遗传性状好的甜菜品系，并对其安全性进本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种通过多基因转化提高甜菜耐盐耐旱性和抗除草剂绿黄隆特性的方法及应用，其主要步骤包括：将来自植物的液泡膜钠氢反向转运蛋白基因ＮＨＸ１和液泡膜焦磷酸酶基因ＰＰａｓｅ、来自大肠杆菌的胆碱脱氢酶基因ｂｅｔＡ和来自拟南芥的抗除草剂绿黄隆的突变的乙酰乳酸合成酶基因ａｌｓ分别重组到植物表达载体中，通过农杆菌介导的方法转入离体培养的甜菜丛生芽芽尖分生组织细胞并高效表达，获得转基因植株；从转基因植株及其后代中筛选耐盐耐旱性明显提高的转基因株系；通过对转基因植株进行二次转化或使带有不同转基因的植株相互杂交获得带有３－４个目标基因的转基因植株；或以含双Ｔ－ＤＮＡ区的植物表达载载体（含有３－４个目标基因）直接转化甜菜细胞，获得带有３－４个目标基因的转基因植株；检测多基因转化植株后代的耐盐性、除草剂抗性和农艺性状，选出耐盐耐旱兼抗除草剂绿黄隆的新种质。

【技术特征摘要】
1.一种通过多基因转化提高甜菜耐盐耐旱性和抗除草剂绿黄隆特性的方法及应用，其主要步骤包括将来自植物的液泡膜钠氢反向转运蛋白基因NHX1和液泡膜焦磷酸酶基因PPase、来自大肠杆菌的胆碱脱氢酶基因betA和来自拟南芥的抗除草剂绿黄隆的突变的乙酰乳酸合成酶基因als分别重组到植物表达载体中，通过农杆菌介导的方法转入离体培养的甜菜丛生芽芽尖分生组织细胞并高效表达，获得转基因植株；从转基因植株及其后代中筛选耐盐耐旱性明显提高的转基因株系；通过对转基因植株进行二次转化或使带有不同转基因的植株相互杂交获得带有3-4个目标基因的转基因植株；或以含双T-DNA区的植物表达载载体(含有3-4个目标基因)直接转化甜菜细胞，获得带有3-4个目标基因的转基因植株；检测多基因转化植株后代的耐盐性、除草剂抗性和农艺性状，选出耐盐耐旱兼抗除草剂绿黄隆的新种质。2.如权利要求1所述的通过多基因转化提高甜菜耐盐耐旱性和抗除草剂绿黄隆特性的方法及应用，其特征是，目标基因NHX1和PPase基因可以融合基因形式串联插入在植物表达载体上，在甜菜细胞内能高效表达；betA和als基因重组在另一植物表达载体上，由在植物细胞内能...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨爱芳，张举仁，谷晓峰，张可炜，尹小燕，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：88[中国|济南]