稳定化的透明质酸制造技术

包含交联透明质酸的无菌水凝胶组合物，其中相对于透明质酸的总量，分子量小于200kDa的可提取的透明质酸的量小于15重量％。可提取的透明质酸的量小于15重量％。

【技术实现步骤摘要】
稳定化的透明质酸
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请是申请日为2019年06月14日、申请号为201980038268.5(PCT/EP2019/065756)、专利技术名称为“稳定化的透明质酸”的分案申请。


[0003]本专利技术涉及包含交联透明质酸的无菌水凝胶组合物和用于作为软组织填充物的该组合物。

技术介绍

[0004]透明质酸(Hyaluronan，缩写为HA，也称为hyaluronic acid)是天然存在的具有由D
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葡糖醛酸和N
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乙酰基
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D
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葡糖胺构成的重复二糖单元的多糖。术语透明质酸(hyaluronan或hyaluronic acid)通常与其盐(例如透明质酸钠)同义地使用。
[0005]高分子量的透明质酸天然存在于皮肤中，并以其粘弹性特性和非常高的吸水性而著称。其性质在很大程度上促进了皮肤的弹性。鉴于其性质及其生物相容、耐受和无毒的特性，已经在医学和美容领域，特别是在美容手术的许多应用中利用该化合物的优点超过10年。例如，透明质酸被用于通过直接注射到所考虑区域的真皮中来填充皱纹(用作皮肤填充物)。
[0006]生物发酵来源的高度纯化的未修饰的透明质酸具有极好的生物相容性，并且与内源性透明质酸相同。然而，透明质酸尽管具有与人体组织高度相容、与水具有高亲和力并且发挥强力保湿功能的优点，但是其不具有足够的生物力学性质。当将透明质酸注射到皮肤组织中时，其通过人体组织中存在的透明质酸酶(酶降解)和自由基(化学降解)在体内迅速降解。
[0007]已经提出了许多解决方案来减慢透明质酸在体内的降解并改变其化学、物理和生物学性质，另外提供制剂对储存过程中的降解、对热以及因此对灭菌的提高的抗性。
[0008]这些方法通常涉及透明质酸的化学修饰，包括例如通过化学、酶促或光化学方法使透明质酸交联。这些交联透明质酸凝胶可以通过多种制备方法获得。通常，这些方法需要两个主要步骤，第一步由使透明质酸水合以使其转化为水溶液组成，并且第二步旨在在能够诱导其交联的试剂(也称为“交联剂”)的存在下使所述水溶液的透明质酸分子交联。交联剂的实例包括甲醛、二乙烯基砜、双碳二亚胺和环氧化物。其它解决方案包括用诸如多肽的大基团对透明质酸进行修饰，以诱导细胞附着或自组装成水凝胶。
[0009]为了生产皮肤填充物，交联剂最通常选自环氧化物如丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)或1,2,7,8
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二环氧辛烷(DEO)、醛、或聚乙烯基砜如二乙烯基砜(DVS)，因此本质上是合成的。
[0010]遗憾的是，透明质酸的化学修饰会导致利用天然具有低免疫原性并且没有毒性的未修饰的透明质酸时未观察到的副作用和异物反应。在大多数市售的透明质酸软组织填充物中，BDDE被用作交联剂。由于BDDE中存在的环氧基的反应性质，软组织填充物中残留的未
反应BDDE可能具有遗传毒性作用。因此，必须将皮肤填充物中的BDDE保持在痕量(<百万分之2)，因此在生产过程中需要昂贵的额外纯化和测试程序。尽管BDDE交联填充物的安全性特性得到了长期临床经验的支持(De Boulle,Glogau等人,2013,Areview of the metabolism of 1,4
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butanediol diglycidyl ether
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crosslinked hyaluronic acid soft tissue fillers,Dermatol Surg(39):1758
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1766)，BDDE仍可能引起一些安全性担忧(Choi,Yoo等人,2015,Modulation of biomechanical properties of hyaluronic acid hydrogels by crosslinking agents,JBiomed Mater Res Part A(103A):3072
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3080)。
[0011]由于与BDDE相关的遗传毒性风险，可能对患者终生施用的市售皮肤填充物产品(例如)的年剂量被限制为每年20ml。市售皮肤填充物产品的施用被限制为每次施用6ml的体积。类似的限制适用于包含DVS交联的透明质酸的软组织填充物。
[0012]化学修饰的另一个问题是透明质酸在交联反应中为了实现期望的交联度而必须经历的必要的严苛反应条件，例如碱性pH值和高温(高于50℃)。已知由于在暴露于酸性(pH低于4)或碱性pH(pH高于10)期间的水解降解，透明质酸的分子量降低。此外，透明质酸在高于40℃的较高温度下降解(Troncoso等人,2016,Akinetic study of the degradation of Hyaluronic acid at high concentrations of sodium hydroxide,学生论文,通过http://uu.diva
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portal.org/smash/get/diva2:954372/FULLTEXT01.pdf在线访问；Stern等人,2007.The many ways to cleave hyaluronan,Biotechnology Advances(25):537
‑
557；Tokita和Okamoto,1996,Degradation of hyaluronic acid
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kinetic study and thermodynamics,Eur.Polym.J.(32):1011
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1014)。还已知分子量小于200kDa的低分子量透明质酸片段具有促炎作用(Naor,2016,Editorial:Interaction Between Hyaluronic Acid and Its Receptors(CD44,RHAMM)Regulates the Activity ofInflammation and Cancer,Frontiers in immunology 7:39；Monslow等人,2015,Hyaluronan
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a functional and structural sweet spot in the tissue microenvironment,Frontiers in immunology 6:231)。
[0013]尽管WO 2014/064632描述了具有使用内源性接头分子稳定的透明质酸的软组织填充物，但是交联过程需要非内源性化学物质来激活透明质酸(在申请中被描述为伪天然交联)。尽管多胺是在所有生物中以相对较高的浓度发现的内源性分子，但是发现这些试剂在过量存在时会显示出令人惊讶的毒性程度(参见Hoet&Nemery,Am.J.Physiol.Lung Cell.Mol.Physiol.；278,L417
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.包含交联透明质酸的无菌水凝胶组合物，其特征在于相对于透明质酸的总量，分子量小于200kDa的可提取的透明质酸的量小于15重量％。2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述可提取的透明质酸是通过使用还原提取或保守提取从所述无菌水凝胶组合物中可提取的透明质酸。3.根据权利要求1或权利要求2所述的组合物，其中所述交联透明质酸具有根据式I的结构HA
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L
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HA(I)，其中每个HA代表根据式II的透明质酸或其盐其中n是大于1的整数，并且决定式II的重复单元的重复数，并且L是接头，所述接头通过替换根据式II的重复单元中的一个OH部分与每个HA共价键合，并且其中L衍生自分子LH2，其中所述分子LH2是人中天然存在的分子或人中天然存在的分子的缀合物。4.根据权利要求3所述的组合物，其中所述接头L是内源性分子的非遗传毒性且非细胞毒性片段。5.根据权利要求3所述的组合物，其中所述分子LH2选自由以下组成的组：谷胱甘肽、半胱胺、半胱氨酸、高半胱氨酸、β
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半胱氨酸、包含半胱氨酸的肽、半胱胺与氨基酸的缀合物及其二硫化物二聚体。6.根据权利要求1至4中一项所述的组合物，还包含至少一种局部麻醉剂。7.根据权利要求5所述的组合物，其特征在于所述局部麻醉剂选自由以下组成的组：利多卡因、阿替卡因、丙胺卡因、氯普鲁卡因、阿替卡因及其组合。8.根据权利要求1至7中一项所述的组合物，还包含无毒的稳定剂。9.根据权利要求1至8中一项所述的组合物，还包含至少一种透明质酸降解抑制剂。10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述抑制剂选自由以下组成的组：1,2,3,4,6
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五
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O
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没食子酰葡萄糖、芹菜素、β
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七叶素、caltrin...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗伯特，
申请(专利权)人：克罗马药品有限责任公司，
类型：发明
国别省市：