一种基于ZrMOFs@PEI@AuAgNCs复合物的双波长ECL传感器及其应用制造技术

一种基于Zr MOFs@PEI@AuAg NCs纳米复合材料的双波长ECL生物传感器及检测双目标miRNAs应用；本发明专利技术的技术方案是利用多功能Zr金属有机骨架@PEI@AuAg纳米团簇复合材料在535nm和644nm两个波长具有较强的ECL，同时利用具有独特稳定刚性的三维DNA四面体结构连接BHQ1和BHQ3两种淬灭探针和步行器walker，该复合结构连接到电极上同时猝灭复合材料的双波长ECL；采用外切酶T7Exo结合DNAWalker进行DNA循环双扩增过程，实现对miRNA

【技术实现步骤摘要】
一种基于ZrMOFs@PEI@AuAgNCs复合物的双波长ECL传感器及其应用

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[0001]本专利技术涉及一种基于Zr MOFs@PEI@AuAg NCs双波长发光的ECL传感器；以及所述传感器的制备及其检测miRNA
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141及miRNA
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155的分析应用。

技术介绍
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[0002]MicroRNA(miRNA)，作为一种基于内源性基因编码的单链RNA结构，涉及到了人体内免疫反应的方方面面，精准地检测痕量的miRNA对人类的健康生活至关重要[Martins,C.S.M.et.al,ACS Sensors,2022,7,1269
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1299.]。电化学发光(ECL)技术灵敏度和准确性高，是现代分析化学中检测痕量物质的一种可信的检测方法。近年来，在使用有机分子作为配体来合成具有ECL发光性质的金属有机骨架MOFs的过程中，不可避免地会发生聚集诱导猝灭(ACQ)现象[Huang,Y.,Wang,Z.,et,al.Angew.Chem.,Int.Ed.Engl.2019,58,9696
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9711.]。有研究发现以Zr离子作为中心节点，选取有聚集诱导发光(AIE)效应的1,1,2,2
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tetra(4
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carboxylbiphenyl)ethylene(H4TCBPE)分子作为连结配体，制备具有聚集诱导电化学发光(AI
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ECL)效应的金属有机骨架Zr
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TCBPE
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MOF(Zr MOFs)，可以提高整体的发光量子产率[Wei,Z.W.,Gu,Z.Y.,et,al.J.Am.Chem.Soc.2014,136,8269.]。同时为了解决有机体导电性差、电子转移效率低的问题，我们选取具有大量叔胺基团的聚亚乙烯亚胺(PEI)分子作为共反应物锚定于Zr MOFs表面，实现二者之间超近距离的电子交换。同时，将具有优良电催化活性与电导率的AuAg NCs负载于Zr MOFs@PEI表面，以加速复合物中电子的转移速率，解决载体Zr MOFs在电子流动方面相对劣势的难题，Zr MOFs又能增强AuAg NCs ECL信号的稳定性。
[0003]本文基于Zr MOFs@PEI@AuAg NCs纳米复合材料与猝灭基团BHQ之间的共振能量转移效应，结合高效的DNA walker循环剪切与高度稳定的三维DNA四面体TDN结构，构建了一种双波长生物传感器可以实现对miRNA
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141与miRNA
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155准确检测。通过灵活多变的碱基配对策略，该传感器可成为各种基因序列的通用检测平台，在未来的临床分析、疾病检测等领域将具有无可比拟的应用价值。

技术实现思路
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[0004]本专利技术的目的之一是合成Zr MOFs@PEI@AuAg NCs纳米复合材料用于构建生物传感器。
[0005]具体包括以下步骤：
[0006]步骤1.六边形片状Zr
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TCBPE
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MOF的合成：首先，取30mg的H4TCBPE与60mg的ZrCl4溶解于3.6mL的DMF中，再加入0.4mL的CH3COOH并在超声作用下混合均匀。然后，将上述混合溶液加至聚四氟乙烯内衬的不锈钢水热反应釜中并在120℃下加热24h，待反应结束并冷却后用二次水和无水乙醇依次洗涤产物三次。最后，将通过离心收集的亮黄色产物置于60℃的烘箱中干燥并保存备用。
[0007]步骤2.金银双金属纳米团簇AuAg NCs的合成：将13.1mL的二次水、1.5mL HAuCl4(20mM)与0.3mL AgNO3(20mM)依次加入50mL规格的三口烧瓶中。之后，将0.45mL的谷胱甘肽(100mM)溶液加至上述混合溶液中，并于室温下搅拌10min，待其混合均匀后，将其置于70℃的水浴锅中加热回流24h。合成的AuAg NCs经超滤离心管(MWCO 3K)离心纯化15min后，置于4℃的环境中避光保存。
[0008]步骤3.Zr MOFs@PEI@AuAg NCs纳米复合材料的合成：第一步，取20mg之前制备的Zr MOFs超声溶解于5mL二次水中，再向其中加入2mL EDC(100mM)与2mL NHS(25mM)溶液并在37℃下活化40min。再将其与5mL的PEI(1％)溶液超声混合，并继续孵育6h，离心纯化并将产物重新分散于5mL二次水中，制备Zr MOFs@PEI复合物。第二步，取500μL之前经超滤离心纯化后的AuAg NCs于等体积的二次水中稀释，再向其中分别加入50μL与之前相同浓度的EDC与NHS溶液进行活化，最后，取1mL之前合成的Zr MOFs@PEI复合物与其混合，并在之前相同的条件下混合孵育，随后经纯化并重分散于1mL的二次水中，得最终产物Zr MOFs@PEI@AuAg NCs纳米复合材料。
[0009]本专利技术的目的之二是合成三维DNA四面体(TDN)来构建多功能的淬灭探针和walker放大器。
[0010]具体包括下步骤：
[0011]三维DNA四面体(TDN)的制备：将以TE缓冲液(10mM Tris
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HCl，1mM EDTA，pH 8.0)为溶剂的50μL的N4(N5，W1或W2)捕获探针(10μM)与同体积同浓度的氨基修饰的DNA链(N1，N2和N3)混合，将混合溶液放置于95℃的水浴锅中加热5min后，再快速转移至4℃的环境中冷却，获得四种稳定的不同TDN结构。上述DNA的序列如下：
[0012][0013][0014]本专利技术的目的之三是首次构建以Zr MOFs@PEI@AuAg NCs纳米复合材料为基础的
双波长生物传感器用于检测多种miRNAs。
[0015]具体包括下步骤：
[0016]步骤1.生物传感器的构建：首先，将自制的ITO电极依次放置于丙酮、1MNaOH(乙醇与二次水体积比为1：1的混合溶液)和二次水中超声15min，从而使电极表面修饰上羟基基团，待其干燥后，用密封膜包缠ITO电极以获得面积为0.25cm2(0.5cm
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0.5cm)的方形区域。
[0017]将10μL10μM的带有猝灭团BHQ1的S1链和BHQ3的S2链分别与之前合成的40μLTDN1和TDN2杂交2h，以获得TDN1+S1
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BHQ1与TDN2+S2
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BHQ3两种杂交体。同理，将10μL10μM的Blocker1链和Blocker2链分别与之前合成的40μLTDN3
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Walker1和TDN4
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Walker2杂交2h，以获得TDN3
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Walker1+Blocker1与TDN4
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Walker2+Blocker2两种杂交体。上述DNA的序列如下：
[0018][0019]接下来，取20μL之前制备的ZrMOFs@PEI@本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于Zr MOFs@PEI@AuAg NCs纳米复合材料的双波长ECL生物传感器及检测双目标miRNAs应用，其特征是：多功能Zr金属有机骨架@PEI@AuAg纳米团簇复合材料在535nm和644nm两个波长具有较强的ECL，同时利用具有独特稳定刚性的三维DNA四面体结构连接BHQ1和BHQ3两种淬灭探针和步行器walker，该复合结构连接到电极上同时猝灭复合材料的双波长ECL；双目标miRNAs存在时，采用外切酶T7 Exo结合DNAWalker进行DNA循环双扩增剪切过程，BHQ1和BHQ3淬灭探针脱离电极，恢复两个波长的ECL信号，实现双目标miRNAs的同时快速ECL检测；2.一种基于Zr MOFs@PEI@AuAg NCs纳米复合材料的双波长ECL生物传感器及检测双目标miRNAs应用，其特征方法由下列步骤组成：步骤1.合成Zr MOFs@PEI@AuAg NCs纳米复合材料：第一步，取20mg之前制备的Zr MOFs超声溶解于5mL二次水中，再向其中加入2mL 100mM EDC与2mL 25mM NHS溶液并在37℃下活化40min。再将其与5mL的1％PEI溶液超声混合，并继续孵育6h，离心纯化并将产物重新分散于5mL二次水中，制备Zr MOFs@PEI复合物；第二步，取500μL之前经超滤离心纯化后的AuAg NCs于等体积的二次水中稀释，再向其中分别加入50μL与之前相同浓度的EDC与NHS溶液进行活化，最后，取1mL之前合成的Zr MOFs@PEI复合物与其混合，并在之前相同的条件下混合孵育，随后经纯化并重分散于1mL的二次水中，得最终产物Zr MOFs@PEI@AuAg NCs纳米复合材料；步骤2.制备三维DNA四面体TDN：配制TE缓冲液，其组成如下：10mM Tris
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HCl，1mM EDTA，pH 8.0，将以TE缓冲液为溶剂的50μL10μM的N4或者N5、W1、W2捕获探针与同体积同浓度的氨基修饰的N1、N2和N3 DNA链混合，将混合溶液放置于95℃的水...

【专利技术属性】
技术研发人员：接贵芬，李志康，
申请(专利权)人：青岛科技大学，
类型：发明
国别省市：