一种基于CRISPR/Cas的电化学核酸检测传感元件及检测方法技术

本发明专利技术涉及电化学分析检测领域，具体涉及一种基于CRISPR/Cas的电化学核酸检测传感元件及检测方法。本发明专利技术提供的一种基于CRISPR/Cas的电化学核酸检测传感元件，包括无固定化的报告分子，所述报告分子包含：至少一个电化学活性分子；和至少一个核苷酸；所述报告分子为非特异性核酸分子；本发明专利技术无需将报告分子固定在电极表面，可以建立均相、实时、无固定化CRISPR/Cas传感体系。打破了以往电极修饰对于电化学检测技术精密性、重现性、重复性的限制，实现了均相下电化学核酸检测进程的实时监测、均相流动下电极对电化学核酸体系的反复检测，检测准确度高、灵敏度高，提升检测性能。提升检测性能。提升检测性能。

【技术实现步骤摘要】
一种基于CRISPR/Cas的电化学核酸检测传感元件及检测方法


[0001]本专利技术涉及电化学分析检测领域，具体涉及一种基于CRISPR/Cas的电化学核酸检测传感元件及检测方法。

技术介绍

[0002]近年来，聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）技术作为核酸的主要检测方式得到了大规模、大范围应用，但该技术依然存在操作步骤繁琐、仪器便携程度较低、检测灵敏度有待提高、专业人员专业环境依赖度极高等显著缺陷。开发更为简便、快速的新一代核酸检测技术，有望脱离专业实验室、专业人员。
[0003]规律成簇间隔短回文重复探针（Cluste Redregularly Interspaced Short Palindromic Repeats, CRISPR）与CRISPR相关蛋白（CRISPR
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associated proteins, Cas）所构成的CRISPR/Cas工具，是新一代基于核酸剪切的基因编辑工具，自发现以来广受关注。CRISPR/Cas工具因其灵敏度高、特异性强、反应快速、操作简单、效率高等显著优势，除了在基因编辑上的独特应用外，也为核酸检测带来了新的可能。CRISPR/Cas核酸检测工具，由Cas蛋白、crRNA、报告分子构成。Cas蛋白、crRNA可以形成稳定的二元复合物，根据Cas蛋白属性不同（如Cas9、Cas12、Cas13和Cas14等），crRNA可根据序列匹配性选择性的与样本中的RNA或ssDNA结合，从而形成Cas/crRNA/RNA或Cas/crRNA/ssDNA三元复合物，由此使得Cas蛋白构象变化具有RNA剪切酶或ssDNA剪切酶的反式切割活性。报告分子由DNA或RNA序列偶联信号分子构成，Cas三元复合物剪切报告分子中的DNA或RNA序列，释放游离的信号分子，从而产生可检测的光学信号、颜色信号等。
[0004]经典CRISPR/Cas工具始终聚焦生物分子特异识别与光信号响应的结合，即报告分子中选用荧光物质作为信号分子，但光信号探测对较为复杂光路系统的依赖，增大了仪器体积、提高了检测成本，限制了其广泛普及使用。新型的CRISPR/Cas工具逐步关注电化学检测简便快速与高灵敏为CRISPR/Cas核酸检测带来性能进一步提升的可能，电化学仪器体积小，构造简单、成本低廉、响应速度快、检测灵敏度高，且以血糖仪为代表的电化学仪器已经成功实现产品化和商业化。

技术实现思路

[0005]因此，本专利技术要解决的技术问题在于提供一种基于CRISPR/Cas的电化学核酸检测传感元件及检测方法。
[0006]为此，本专利技术提供了如下的技术方案：一种基于CRISPR/Cas的电化学核酸检测传感元件，包括无固定化的报告分子，所述报告分子为非特异性核酸分子，所述报告分子上包含：至少一个电化学活性分子；和至少一个核苷酸。
[0007]所述报告分子为非特异性核酸分子，即不发生配对识别的非特异性核酸分子。
[0008]可选的，所述报告分子上包含有至少一个修饰基团：所述修饰基团修饰在所述报告分子的一端、中间或两端；和/或所述修饰基团为具有一定空间位阻，在电活性物质氧化还原峰附近不产生干扰峰的大分子物质。
[0009]可选的，所述修饰基团为羧基荧光素、生物素和地高辛中的至少一种；和/或所述电化学活性分子修饰在所述报告分子的一端、中间或两端；和/或所述电化学活性分子包括二茂铁、亚甲基蓝和硫堇中的至少一种。
[0010]可选的，所述非特异性核酸分子为DNA链、RNA链或DNA/RNA掺杂链；和/或所述非特异性核酸分子的长度为1~ 26个碱基。
[0011]可选的，还包括Cas蛋白、crRNA和/或反应缓冲液。
[0012]可选的，所述Cas蛋白包括Cas9、Cas12、Cas13和Cas14中的至少一种；和/或所述Cas蛋白和crRNA的摩尔浓度比范围为4 : 1 ~ 1 : 4；和/或所述报告分子浓度范围为1 ~ 50 μM；和/或所述反应缓冲液中含有Tris
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HCl为10~50 mM、KCl或NaCl为30~120 mM、MgCl2为1~ 20 mM和BSA为80~130 μg/ml。
[0013]可选的，所述Cas蛋白和crRNA的摩尔浓度比范围为2:1；和/或所述报告分子浓度范围为5~ 10 μM；和/或所述反应缓冲液中含有Tris
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HCl为20~40 mM、KCl或NaCl为40~80 mM、MgCl2为1.5~ 10 mM和BSA为90~100 μg/ml。
[0014]一种基于CRISPR/Cas的电化学核酸检测方法，包括：利用所述的基于CRISPR/Cas的电化学核酸检测传感元件构建CRISPR/Cas反应体系，然后加入待测样本，进行反应，采用非修饰电极进行实时电化学信号检测。
[0015]可选的，所述反应时间为5 ~ 60 min，反应温度为5 ~ 50℃；和/或所述非修饰电极包括丝网印刷电极。
[0016]可选的，所述反应时间为15 ~ 30 min，反应温度为20~ 40℃；和/或所述非修饰电极包括金电极、铂电极、石墨电极或碳电极。
[0017]本专利技术技术方案，具有如下优点：1.本专利技术提供的一种基于CRISPR/Cas的电化学核酸检测传感元件，包括无固定化的报告分子，所述报告分子为非特异性核酸分子，所述报告分子包含：至少一个电化学活性分子；和至少一个核苷酸；所述报告分子为不发生配对识别的非特异性核酸分子；本专利技术在研究过程中发现，基于CRISPR/Cas的电化学核酸检测中，一般均是报告分子一端连接电化学活性分子，另一端固定在电极表面，随着反应的进行对报告分子进行剪切，释放电活性物质，使得电活性物质远离电极表面，电信号下降，实现电化学检测，研究思路局限在报告分子固定电极
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远离电极的方式中，然而本专利技术发现，采用上述的固定电极
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远离电极的方法，在“精密性、重复性”方面，存在由于电极表面需修饰报告分子，使得电极的制备工艺复杂、批间差大、无法重复使用；在“灵敏度、特异性”方面，存在由于固相
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液相反应模式限制布朗运动分子碰撞效率又无法阻止碰撞发生，使得灵敏识别时报告分子剪切效率低、特异检测时游离活性分子碰撞电极产生干扰信号；在“定量性、检测限”方面，存在由于检测信号与靶标浓度反比，使得检测结果的高噪声无法剔除线性响应差、弱信号难于提取检测限差，综合
导致检测性能提升受到严重制约。本专利技术发现当该报告分子无固定化游离在反应体系内时，由于报告分子与CRISPR/Cas复合物均为均相，极大提升了二者碰撞效率提升带来的高剪切效率，同时当报告分子被剪切后，被释放的电活性物质分子更小扩散速率更大，比报告分子具有更为优势的碰撞电极产生信号的能力，从而呈现了明确的检测靶标浓度正相关的电信号增强，因而实现了灵敏度的提升、正相关响应的构建。综上，本专利技术取代报告分子电极固定的思路，建立了均相、无固定本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1. 一种基于CRISPR/Cas的电化学核酸检测传感元件，其特征在于，包括无固定化的报告分子，所述报告分子为非特异性核酸分子，所述报告分子上包含：至少一个电化学活性分子；和至少一个核苷酸。2.根据权利要求1所述的基于CRISPR/Cas的电化学核酸检测传感元件，其特征在于，所述报告分子上包含有至少一个修饰基团：所述修饰基团修饰在所述报告分子的一端、中间或两端；和/或所述修饰基团为具有一定空间位阻，在电活性物质氧化还原峰附近不产生干扰峰的大分子物质。3.根据权利要求2所述的基于CRISPR/Cas的电化学核酸检测传感元件，其特征在于，所述修饰基团为羧基荧光素、生物素和地高辛中的至少一种；和/或所述电化学活性分子修饰在所述报告分子的一端、中间或两端；和/或所述电化学活性分子包括二茂铁、亚甲基蓝和硫堇中的至少一种。4.根据权利要求1或2所述的基于CRISPR/Cas的电化学核酸检测传感元件，其特征在于，所述非特异性核酸分子为DNA链、RNA链或DNA/RNA掺杂链；和/或所述非特异性核酸分子的长度为1~ 26个碱基。5.根据权利要求1或2所述的基于CRISPR/Cas的电化学核酸检测传感元件，其特征在于，还包括Cas蛋白、crRNA和/或反应缓冲液。6.根据权利要求5所述的基于CRISPR/Cas的电化学核酸检测传感元件，其特征在于，所述Cas蛋白包括Cas9、Cas12、Cas13和Cas14中的至少一种；和/或所述Cas蛋白和crRNA的摩尔浓度比范围为4 : 1 ~ 1 : ...

【专利技术属性】
技术研发人员：周蕾，董金营，吴晓雅，邵高祥，张悦，孟凡伟，杜英侠，胡秋实，孙崇思，
申请(专利权)人：中国科学院过程工程研究所，
类型：发明
国别省市：