检测高危型人乳头瘤病毒的免疫胶体金测试卡及其测试方法技术

本发明专利技术提供一种检测高危型人乳头瘤病毒的免疫胶体金测试卡，其试纸条由背衬、样品垫、结合垫、ＮＣ膜和吸水垫组成，背衬上中部设有ＮＣ膜，ＮＣ膜的两端分别相邻连接结合垫和吸水垫；样品垫设于结合垫的上方；结合垫上喷有金标抗体Ｇ－Ａｂ１，所喷涂的金标抗体Ａｂ１为高危型人乳头瘤病毒ＨＰＶ１６单克隆抗体；ＮＣ膜上分别喷有呈直线的抗高危型人乳头瘤病毒ＨＰＶ１６多克隆抗体Ａｂ２，以及抗金标抗体的抗体即兔抗鼠ＩｇＧ抗抗体Ａｂ３。本发明专利技术首次将免疫胶体金技术应用于高危型人乳头瘤病毒的快速检测中，可简单快速检测妇女宫颈粘液中的高危型人乳头瘤病毒；而且该高危型人乳头瘤病毒快速检测试纸条不需实验设备，方便用于临床的快速诊断，适应于各级医院对宫颈癌的筛查。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及免疫胶体金测试卡技术，具体涉及一种可快速诊断高危型人乳头瘤病毒感 染16型的人乳头瘤病毒免疫胶体金测试卡及其测试方法。
技术介绍
人乳头状瘤病毒(Human papilloma virus, HPV16)是一种嗜上皮性病毒，在人和动 物中分布广泛，有高度的特异性，HPV感染通常引起生殖器疣、子宫颈及泌尿生殖道癌。HPV 病毒几乎是所有宫颈癌的元凶。男性感染该病毒后不会死亡，但会通过性行为、皮肤接触 等传染给女性伴侣。感染HPV病毒的初期症状是手上、下腹部或生殖器部位表面出现细而 密的疣状乳头状瘤。病毒的潜伏期有可能长达15年，病变发展缓慢，而且并不是所有的 被感染者身体表面都会出现这些症状，因此往往被忽视。 一旦女性感染者机体免疫力下降， 病毒活动就会加剧，最终导致宫颈恶性肿瘤。据报道，细胞学正常的妇女宫颈HPV感染率 为10.2% 40.0%。全世界学者们经过近20年的大量研究表明，宫颈的高危型HPV持续 感染是引起宫颈癌及癌前病变的直接病因。Mattheus等报道，在99. 7%的浸润性宫颈癌 中可以检测到13种高危型HPV，其中HPV16 (53%)、 HPV18 (15%)等高危型的感染是引起 宫颈癌变的首要因素。HPV检测广泛应用于与HPV有关的恶性病变自然史和病因学的研究， 目前它正在成为宫颈癌的另一种或是附加的筛检方法，对宫颈癌的预防及治疗有着非常重 要的意义。目前HPV感染的检测方法有三类 一是传统的检测方法及其改进由于HPV在体外不能增殖，传统方法主要是通过形态学方法和免疫学方法检测HPV。前者包括巴氏涂片细 胞病理学检测、阴道镜检査、宫颈活检组织病理学检査、电镜技术(直接观察病毒颗粒)、 宫颈摄像检査和宫颈荧光检査等；后者包括应用免疫组化法通过抗L1蛋白抗体与外壳蛋 白抗体反应检测HPV、采用放射免疫沉淀法测定宫颈上皮细胞内瘤变(CIN)和宫颈癌患者 血清中的HPV16抗体水平，用血清免疫吸附试验(ELISA)检测血清中的HPV、 E6、 E7特 异性抗体蛋白。目前在宫颈癌的筛査中应用最多的是巴氏涂片法。在合理应用巴氏涂片法 筛査的地区，其宫颈癌的发生率下降70%，但此方法存在两个问题(一)是假阴性率高。 (二)是巴氏涂片分类目前采用的标准是经修订的Bethesda分类系统，该系统虽广为接 受，但人有一些缺陷，每年有大量巴氏涂片报告为性质未定非典型鳞形细胞，如何妥善处 理这类患者、节约资源并提高筛査率是个棘手的问题。随着一些新技术新方法的引入，出现了改良的巴氏涂片。包括A、 Auto Pap 300QC: 将自动显微镜检与计算机分析相结合，通过重新检测初筛中漏检的异常细胞而减少误诊 率。B、 PAPENT该系统包括扫描仪和分析平台两部分。它选择128个最异常的细胞并将其 贮存起来，供细胞学家确认后作出诊断。C、 Thi叩r印2000 :是半自动的、基于液态的涂 片制备系统。通过将宫颈拭子收集的标本置于缓冲液中，并转移到实验室制备薄层涂片。 它只使用一部分细胞，因而留在缓冲液中的剩余细胞可做HPV-DNA检测。D、 CYTORICH: 是新的宫颈细胞单层涂片制备系统。将传统方法制备完以后的残余脱落细胞悬浮后通过梯 度离心沉淀的方法分离上皮细胞成分。以上这些传统方法的特异性和灵敏性均不够理想， 存在较高的假阴性率和假阳性率，也不能对HPV分型，所以目前HPV的主要实验诊断技术 是应用分子生物学方法进行HPV-DNA的检测。三、分子生物学检测方法分子生物学检测方法包括基于核酸杂交的方法和基于PCR 的方法。目前用于HPV-DNA检测的核酸杂交方法有多种(l)Southern blot被认为是HPV 检测的金标准。其过程包括DNA抽提、酶切、电泳、变性、吸印、烤膜、预杂交、杂交、检测分析等步骤。该方法灵敏度高。适于HPV分型、HPV-DNA分子量鉴定、基因组酶切图 谱建立及物理状态研究。但费时且必须用新鲜组织标本，现在不便于临床应用。(2)斑点 杂交是简化了的Southern blot，经济实用、灵敏度较高，用于筛选实验。FDA已批准 此法用于临床。Digene公司生产的HPV-PROFILE试剂盒，总共有14个HPV型别，分别为 低危组的HPV-6、 11、 42、 43、 44和高危组的HPV-16、 18、 31、 33、 35、 45、 51、 52、 56。 (3)原位杂交它应用非放射性探针对石蜡包埋的组织进行检测。优点是能定位，假阳 性率低。但灵敏度不高，只能检测到20-50个病毒/细胞，该缺陷大大降低了其临床应用 价值，且它的假阴性率很高。(4)杂交俘获DNA分析是由Digene公司推出的非放射 性HPV分析系统，联合应用高效液相杂交方法和敏感的化学发光信号扩增系统。能检测14 种HPV型别，可定量，其灵敏度和特异性均较好，适于HPV-DNA的分型及定量分析，但存 在交叉污染问题。PCR(聚合酶链反应)从特异性和灵敏性看，PCR是目前最好的HPV检测方法，简便 易行并可应用型特异性引物进行HPV分型。缺点是容易发生样品间的交叉污染，导致假阳 性率高。最近，在原来的L1通用引物PCR基础上，出现很多新的基于PCR的诊断方法 (1)分子信标引物扩增与反向杂交相结合的方法此法应用一种含有茎环结构的HPV特 异性引物，其中的荧光供体和猝灭基团相距很近，从而发生荧光猝灭。此法用于HPV感染 的大规模人群调查研究。(2)实时PCR荧光分析这是最近研发的基于PCR的5'外切核 酸酶荧光探针HPV定量分析方法，主要针对HPV6、 11、 16、 18四个型别，其特异性和灵 敏性较高，可直接定量检测。(3)间接原位PCR 其优点是所需细胞样本量少，可保存 涂片的细胞学特征。近年来，HPV的检测尤其是HPV-DNA检测进展迅速，在宫颈癌及癌前病变筛査和癌前 预报中发挥了重要作用。但HPV-DNA检测在宫颈癌筛查中还存在一些局限性，主要表现在 A、 HPV感染率很高；B、 HPV感染通常为一过性，尤其在应用高度敏感DNA检测方法时该现象更明显；C、只有那些致癌性HPV型别的持续存在以及他们与宿主基因组的整合才是 有价值的癌前标志。D、 PCR检测法假阴性率较高、进行分型时操作繁琐、 一次性检测的样 本量有限、不便于鉴定未知型别，因而限制了其在大规模筛査中的应用；E、近年发展的DNA 芯片技术具有高度的并行性、多样性、微型化和自动化等优点，已广泛应用于基因定位、DNA 测序、突变检测、基因筛选、基因诊断等DNA研究领域。目前采用的HPV检测方法都有各 自的优缺点，都有共同的局限费时和操作程序复杂。因此建立适于各级医院使用的高危 型人乳头瘤病毒的简单高效特异快速的诊断方法迫在眉睫。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述不足，本专利技术的目的是提供一种对HPV16感染作出简单快速 诊断的高危型人乳头瘤病毒免疫胶体金测试卡，以及使用此测试卡的测试方法，以达到在 各级医院使用的快速特异诊断高危型人乳头瘤病毒16感染的目的。本专利技术的目的是这样实现的检测高危型人乳头瘤病毒16的免疫胶体金测试卡，包 括试纸条和测试卡盒；其特征在于，试纸条由背衬、样品垫、结合垫、NC膜和吸水滤纸组 成，背衬上本文档来自技高网...

【技术保护点】
检测高危型人乳头瘤病毒的免疫胶体金测试卡，包括试纸条和测试卡盒；其特征在于，试纸条由背衬、样品垫、结合垫、ＮＣ膜和吸水滤纸组成，背衬上中部设有ＮＣ膜，ＮＣ膜的两端分别相邻连接结合垫和吸水滤纸；样品垫设于结合垫的上方；结合垫上喷有金标抗体Ｇ－Ａｂ１，所喷涂的金标抗体Ｇ－Ａｂ１为高危型人乳头瘤病毒ＨＰＶ１６单克隆抗体；ＮＣ膜上分别喷有呈直线的抗高危型人乳头瘤病毒ＨＰＶ１６多克隆抗体Ａｂ２，以及抗金标抗体的抗体即兔抗鼠ＩｇＧ抗抗体Ａｂ３；　金标抗体固定于ＮＣ膜上作为显色源，兔 抗ＨＰＶ１６Ｅ６多抗喷画在ＮＣ膜上作为捕获线，兔抗鼠ＩｇＧ的抗抗体即二抗固定在ＮＣ膜上作为质检线。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：胡仁建，蔡家利，吴胜昔，范开，
申请(专利权)人：重庆理工大学，
类型：发明
国别省市：85[中国|重庆]