包含SHP2C-SH2结构域的靶向HER2阳性肿瘤的CAR-T及制备方法和应用技术

本发明专利技术属于细胞生物学领域，具体涉及一种包含SHP2C

【技术实现步骤摘要】
包含SHP2 C
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SH2结构域的靶向HER2阳性肿瘤的CAR
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T及制备方法和应用


[0001]本专利技术属于细胞生物学领域，具体涉及一种包含SHP2C
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SH2结构域的靶向HER2阳性肿瘤的新型CAR
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T细胞及制备方法和应用。

技术介绍

[0002]人表皮生长因子受体2(Human Epidermal Growth Factor Receptor 2,HER2)是一种细胞来源的原癌基因，又称为c
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erbB
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2基因，在多种肿瘤中过度表达和扩增。过多的HER2蛋白出现在肿瘤细胞表面会促进肿瘤细胞的分裂和生长，进而形成HER2阳性肿瘤。HER2过表达常见于乳腺癌、胃癌、肠癌等肿瘤中。
[0003]CAR
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T细胞疗法(Chimeric Antigen Receptor T
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Cell Immunotherapy)全称为嵌合抗原受体T细胞免疫疗法，是一种新型的治疗肿瘤的精准靶向疗法。研究发现，CAR
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T细胞能够精准、快速、高效、特异地识别并杀伤肿瘤细胞，近几年通过优化改良在协助肿瘤的治疗上取得了良好的效果，是一种非常有前景且有可能治愈癌症的新型肿瘤免疫治疗研究方向。但目前CAR
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T疗法在不同肿瘤,尤其是在实体瘤的效果上仍存在争议，实体瘤是CAR
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T疗法亟待攻克的一个具有挑战性的目标。
[0004]Src同源2结构域蛋白酪氨酸磷酸酶(Src homology
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2domain
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containing protein tyrosine phosphatase 2,SHP2)是一种去磷酸化酶，属于蛋白酪氨酸磷酸酶家族。SHP2全长由两个SH2结构域(N
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SH2和C
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SH2)、一个保守的PTP结构域和一个灵活的C末端尾组成。完整的SHP2磷酸酶活性受其自身构象变化而调控，基态时N
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SH2结构域与PTP结构域结合并直接阻断其活性位点，保持自抑制构象；当SHP2的信号蛋白在被肿瘤细胞的信号激活后，上游受体酪氨酸激酶(Receptor Tyrosine Kinase，RTK)会触发PD1上的pTyr(磷酸化的酪氨酸)残基与SHP2两个SH2结构域结合，将PTP结构域从自抑制状态释放，传递激活PD1下游信号，从而抑制T细胞活性。
[0005]综上所述，本专利技术将提供一种结构改良的特异性靶向HER2阳性表达肿瘤细胞的新型CAR
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T细胞，以补充现有研究的不足。

技术实现思路

[0006]有鉴于此，本专利技术的主要目的在于提供一种包含SHP2C
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SH2结构域的特异性靶向HER2阳性肿瘤的新型CAR
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T及制备方法和应用，具体技术方案如下。
[0007]一种靶向HER2阳性肿瘤的嵌合抗原受体，包括胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，所述胞外结构域为靶向HER2阳性肿瘤的纳米抗体(简称HER2纳米抗体)，所述胞内结构域包括SHP2蛋白结构域；所述SHP2蛋白结构域为C
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SH2结构域，其核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示。
[0008]进一步，所述嵌合抗原受体的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。
[0009]进一步，所述胞内结构域还包括4
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1BB共刺激分子和CD3ζ截短信号域，其中CD3ζ优
选为截短的仅含有ITAM1部分。
[0010]进一步，所述嵌合抗原受体还包括CD8铰链区和跨膜区。
[0011]表达上述任一项所述的嵌合抗原受体的CAR
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T细胞。
[0012]上述CAR
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T细胞在制备抗肿瘤药物中的应用，所述CAR
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T细胞中的SHP2 C
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SH2结构域用于竞争性结合PD
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1，阻碍PD
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1和/或PD
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L1免疫抑制信号的传递。
[0013]进一步，所述肿瘤为HER2阳性表达的实体肿瘤。
[0014]进一步，所述实体肿瘤包括卵巢癌、乳腺癌、胃癌或肠癌等。
[0015]上述嵌合抗原受体的制备方法，包括以下步骤：
[0016]1)合成包括靶向HER2阳性肿瘤的纳米抗体、CD8铰链区、跨膜区、4
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1BB共刺激分子、CD3ζ截短信号域和SHP2 C
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SH2结构域的CAR结构；
[0017]2)用限制性内切酶分别对质粒载体和合成的CAR结构进行双酶切，以T4连接酶连接后进行转化和筛选培养，将得到的阳性克隆进行测序鉴定。
[0018]进一步，扩增所述SHP2 C
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SH2结构域的引物序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。
[0019]有益技术效果
[0020]本专利技术提供了一种结构改良的新型靶向HRE2阳性肿瘤细胞的CAR
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T，本专利技术CAR
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T结构中的SHP2 C
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SH2结构域可以用于竞争性结合PD
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1，阻碍PD
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1和/或PD
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L1免疫抑制信号的传递，进而维持T淋巴细胞的免疫活性状态，持续保持对HER2阳性表达的肿瘤细胞具有杀伤效果。
[0021]其次，虽然目前有研究显示PD1上的pTyr残基可以与SHP2的两个SH2结构域结合。但本专利技术实验验证，单独的SHP2 C
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SH2片段并不能发挥理想的抗肿瘤效力，特征是在效靶比E:T＝1:1时(E代表Effector cell，即效应细胞；T代表Target cell，即肿瘤细胞)，在连续杀伤24小时后，本专利技术制备的CAR
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T细胞已经可以看出明显的杀伤/杀死肿瘤的效果，而单独的SHP2 C
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SH2片段却几乎没有发挥出抗肿瘤效果。由此可见，本专利技术制备的CAR
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T细胞在免疫治疗领域具有很大的潜力。
附图说明
[0022]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。
[0023]图1为本专利技术合成的CAR结构(Her2 VH
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BBZ
(short)
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P2A
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SHP2C
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SH2)示意图；
[0024]图2为本专利技术合成的CAR阳性表达率结果图(APC为荧光染料，H代表高度；本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种靶向HER2阳性肿瘤的嵌合抗原受体，包括胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域，其特征在于，所述胞外结构域为靶向HER2阳性肿瘤的纳米抗体，所述胞内结构域包括SHP2蛋白结构域；所述SHP2蛋白结构域为C
‑
SH2结构域，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。2.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。3.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述胞内结构域还包括4
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1BB共刺激分子和CD3ζ截短信号域。4.如权利要求1所述的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体还包括CD8铰链区。5.一种CAR
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T细胞，其特征在于，表达如权利要求1
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4任一项所述的嵌合抗原受体。6.权利要求5所述的CAR
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T细胞在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述CAR
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T细胞中的SHP2 C
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【专利技术属性】
技术研发人员：杨寒朔，罗慧，
申请(专利权)人：四川大学华西医院，
类型：发明
国别省市：