一种筛选家禽RNA病毒源siRNA方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种筛选家禽RNA病毒源siRNA的方法及其应用。本发明专利技术筛选家禽病毒源siRNA方法是基于NCBI GEO数据库中GSE数据集的小RNA与相应参考文献的病毒毒株序列进行比对。其次，通过基因组可视化软件IGV比对可知，IBVM41病毒源siRNA富集区为IBV M41 NSP10siRNA富集区序列。我们将IBVM41 NSP10siRNA富集区序列克隆至能高效表达siRNA的pSilencer4.1载体中，构建成PS

【技术实现步骤摘要】
一种筛选家禽RNA病毒源siRNA方法和应用


[0001]本专利技术属于分子生物检测
，具体涉及一种筛选家禽RNA病毒源siRNA的方法和应用，具体涉及基于病毒源siRNA富集区的选择和IBV
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siRNA富集片段质粒的构建与应用。

技术介绍

[0002]近年来，随着在我国家禽养殖业的快速发展，家禽病毒性传染病的频繁爆发也给我国家禽养殖业造成了巨大经济损失。值得注意的是，RNA病毒造成的影响尤为严重，如鸡传染性支气管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus，IBV)中QX与M41亚型、甲型流感病毒(Influenza A virus，AIV)的H9N2以及鸡新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)中的F48E9以及LaSota毒株等。其中，RNA病毒的高频突变重组使得疫苗的研发和使用存在滞后性和保护力不足。然而，近年来研究者在家禽RNA干扰(RNA interference，RNAi)系统的研究给我们对家禽RNA病毒的防控提供了新的思路。
[0003]RNAi是真核生物中存在的高度保守的一种基因沉默机制，主要由21～23nt小非编码RNA(microRNA和siRNA)特异性沉默mRNA，抑制靶基因表达。RNAi介导的抗病毒免疫途径主要分为3个阶段：dsRNA(Double strand RNA，dsRNA)的产生、Dicer的切割以及RNA诱导的沉默复合体(RNA
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induced silencing complex,RISC)降解作用。第一阶段是病毒基因组RNA复制产生dsRNA。病毒进入宿主细胞后，病毒的基因组RNA首先作为mRNA翻译出病毒的RNA依赖的RNA聚合酶(RNA dependent RNA polymerase，RdRP)，然后以病毒的基因组RNA作为模板在RdRP的作用下合成新的基因组RNA。在RdRP对模板进行复制期间，旧链和新链会形成中间体dsRNA，这时dsRNA诱发第二阶段的切割。第二阶段是Dicer将dsRNA切割成21
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23nt的病毒源siRNA。第三阶段是切割后的小RNA与Argonaute2蛋白(Ago2)装配形成RISC，靶向降解病毒的基因组RNA。
[0004]目前，家禽RNAi抗病毒系统的优势在于其保留着两个具有催化酶活性的RNase III成员Drosha和Dicer，有着完善的RNAi抗病毒系统。其中，核糖核酸内切酶Dicer可对病毒复制过程中产生的dsRNA切割成病毒源siRNA。直至现阶段，国内外仅有少量相关研究表明家禽的禽流感病毒和传染性法氏囊病毒均可以调控siRNA的生成抑制病毒复制。其痛点在于，家禽病毒源siRNA数据库的未建立使得我们对家禽RNA病毒感染产生的siRNA研究仍然处于早期阶段。

技术实现思路

[0005]专利技术目的：鉴于此，本专利技术的所要解决的技术问题是提供了一种筛选家禽RNA病毒源siRNA的方法。
[0006]本专利技术还要解决的技术问题是提供了IBV,AIV和NDV的siRNA富集区片段以及他们对应的siRNA数据库。
[0007]本专利技术还要解决的技术问题是提供了上述制备不同禽类病毒的富集片段质粒的
方法以及其应用。
[0008]技术方案：为了解决上述技术问题，本专利技术提供了一种家禽筛选RNA病毒源siRNA的方法，包括以下步骤：在NCBI的GEO数据库对GSE数据集中的siRNA与相应病毒的序列比对，匹配上病毒的序列以及长度为21
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23nt的siRNA，即为病毒源siRNA。
[0009]其中，所述病毒源包括IBV病毒毒株、AIV病毒毒株或NDV病毒毒株；优选地，所述IBV病毒毒株包括QX亚型或M41亚型。
[0010]本
技术实现思路
还包括一种家禽RNA病毒源的siRNA富集区基因片段的筛选方法，包括筛选家禽RNA病毒源siRNA的方法，还包括将收集得到的病毒源siRNA序列数据，通过snapgene软件与相应病毒基因组序列进行分析比对，再将分析比对的数据使用IGV软件进行数据可视化，得到相应病毒基因组序列上siRNA最多的区域，即为RNA病毒源的siRNA富集区片段。
[0011]其中，IBV病毒毒株siRNA富集区根据对应的QX毒株或M41毒株的核苷酸序列进行筛选；AIV病毒毒株siRNA富集区根据H9N2毒株中的PB2、PB1、PA、HA、NA、M、NEP和/或NS1核苷酸筛选获得；NDV病毒毒株siRNA富集区根据LaSota或F48E9毒株的核苷酸序列筛选获得。
[0012]本
技术实现思路
还包括一种家禽RNA病毒源的siRNA富集区基因片段，所述siRNA富集区基因片段包括IBV组病毒源siRNA富集区、AIV组病毒源siRNA富集区或NDV组病毒源siRNA富集区；作为优选地，包括IBV M41亚型病毒源siRNA富集区为NSP10，所述IBV M41 NSP10 siRNA富集区核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，优选的，AIV组H9N2病毒源siRNA富集区核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，优选的，NDV组F48E9病毒源siRNA富集区核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0013]本
技术实现思路
还包括一种家禽RNA病毒源的siRNA富集区重组质粒或细胞系，其特征在于，所述重组质粒或细胞系包括将所述的基因片段。
[0014]其中，所述重组质粒是将所述的基因片段导入质粒中获得，作为优选，所述质粒包括psliencer 4.1。
[0015]本
技术实现思路
还包括一种家禽RNA病毒源的siRNA富集区重组质粒的构建方法，包括以下步骤：将所述的RNA病毒源的siRNA富集区基因片段导入质粒中即得。
[0016]本
技术实现思路
还包括siRNA、所述的基因片段或所述的重组质粒或细胞系或在制备预防或治疗RNA病毒源感染疾病的药物或疫苗中的应用。
[0017]优选的，IBV组进行siRNA序列比对的毒株为QX与M41，对应的QX毒株的QX GenBank号：ON350837.1，M41毒株IBV M41 GenBank号：MK937830.1。
[0018]优选的，AIV组进行siRNA序列比对的毒株为H9N2,H9N2毒株片段1(PB2)核苷酸序列Genbank号为KP865892.1，片段2(PB1)核苷酸序列Genbank号为KP865845.1，片段3(PA)核苷酸序列Genbank号为KP865799.1，片段4(HA)核苷酸序列Genbank号为KP865958.1，片段6(NA)核苷酸序列Genbank号为KP866002.1，片段7(M)核苷酸序列Genbank号为KP866046.1，片段8(NEP、NS1)核苷酸序列Genbank号为KP866088.1。
[0019]优选的，NDV组进行siRNA序列比对的毒株为LaSota和F48E9，LaSota毒株核苷酸序列Genbank号为J本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种家禽筛选RNA病毒源siRNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：在NCBI的GEO数据库对GSE数据集中的小RNA与相应病毒的序列比对，匹配上病毒的序列以及长度为21
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23nt的siRNA，即为病毒源siRNA。2.根据权利要求1所述的筛选家禽RNA病毒源siRNA的方法，其特征在于，所述病毒源包括IBV病毒毒株、AIV病毒毒株或NDV病毒毒株；优选地，所述IBV病毒毒株包括QX亚型或M41亚型。3.一种家禽RNA病毒源的siRNA富集区基因片段的筛选方法，其特征在于，包括权利要求1或2的筛选家禽RNA病毒源siRNA的方法，还包括将收集得到的病毒源siRNA序列数据，通过snapgene软件与相应病毒基因组序列进行分析比对，再将分析比对的数据使用IGV软件进行数据可视化，得到相应病毒基因组序列上siRNA最多的区域，即为RNA病毒源的siRNA富集区片段。4.根据权利要求3所述的家禽siRNA富集区基因片段的筛选方法，其特征在于，所述IBV病毒毒株siRNA富集区根据对应的QX毒株或M41毒株的核苷酸序列进行筛选；AIV病毒毒株siRNA富集区根据H9N2毒株中的PB2、PB1、PA、HA、NA、M、NEP和/或NS1核苷酸筛选获得；NDV病毒毒株siRNA富集区根据LaSota或F48E9毒株的核苷酸序列筛选获得。5.一种家禽RNA病...

【专利技术属性】
技术研发人员：林建，吴耀棠，吴洋，杨倩，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：