新型昆虫抑制性蛋白质制造技术

本发明专利技术公开了表现出针对鳞翅目害虫物种的毒性活性的杀害虫性蛋白质，所述蛋白质包括但不限于TIC4029、TIC4029_1和TIC4029_8。提供了DNA构建体，所述DNA构建体含有编码所公开的杀害虫性蛋白质中的一种或多种的重组核酸序列。提供了对鳞翅目侵扰具有耐受性的转基因植物、植物细胞、种子和植物部分，所述转基因植物、植物细胞、种子和植物部分含有编码所述TIC4029类的杀害虫性蛋白质的重组核酸序列。还提供了对于检测生物样品中存在所述重组核酸序列或所述TIC4029类的蛋白质的方法，以及使用TIC4029、TIC4029_1和TIC4029_8杀害虫性蛋白质中的任一种来防治鳞翅目物种害虫的方法。法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】新型昆虫抑制性蛋白质
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2020年12月21日提交的美国临时申请63/128,775的权益，该临时申请以引用的方式整体并入本文。
[0003]序列表的并入
[0004]名称为―MONS484WO
‑
sequence_listing.txt”的文件包含DOS操作系统生成的计算机可读形式的序列表，该文件创建于2021年12月9日。该文件为48,197字节(在中测量)，通过电子提交(使用美国专利局EFS
‑
Web提交系统)方式与本申请同时提交，并且以引用的方式整体并入本文。


[0005]本专利技术整体涉及昆虫抑制性蛋白质领域。公开了一类新型蛋白质，所述蛋白质表现出针对作物植株和种子的农业相关害虫，尤其是鳞翅目昆虫物种的昆虫抑制性活性。提供了植物、植物部分和种子，包括植物和微生物细胞，以及含有编码所公开的毒素蛋白中的一种或多种的重组多核苷酸构建体的载体。

技术介绍

[0006]提高具有重要农业意义的植物(包括玉米、大豆、甘蔗、水稻、小麦、蔬菜和棉花等等)的作物产量变得越来越重要。除了越来越需要农产品来为不断增长的人口提供食物、衣服以及提供能量之外，气候相关的影响以及不断增长的人口对将土地用于农业实践以外的用途带来的压力预计会减少可用于耕作的可耕地的数量。这些因素产生了对粮食安全的严峻预测，尤其是在植物生物技术和农艺实践无重大改进的情况下。鉴于这些压力，技术、农业技术和害虫管理方面的环境可持续性改进是在有限的可用于耕作的可耕地上扩大作物生产的重要工具。
[0007]昆虫，尤其是鳞翅目昆虫，被认为是损害大田作物，从而降低受侵染区域的作物产量的主要原因。对农业产生负面影响的鳞翅目害虫物种包括但不限于：豆芽蛾(豆茎蛾)、黑粘虫(考斯夜蛾)、黑地蚕(小地老虎)、玉米穗虫(玉米耳虫)、棉叶虫(棉叶波纹夜蛾)、小菜蛾(小菜蛾)、欧洲玉米螟(欧洲玉米螟)、秋粘虫(草地贪夜蛾)(包括Cry1Ab、Cry1Ac和Cry1Fa耐受性草地贪夜蛾)、旧大陆棉铃虫(OWB，棉铃虫)、南部行军虫(南部灰翅夜蛾)、大豆尺蠖(大豆尺蠖)、斑点棉铃虫(棉斑实蛾)、西南玉米螟(西南玉米螟)、甘蔗螟(小蔗螟)、向日葵尺蠖(薄荷灰夜蛾(Rachiplusia nu))、烟草蚜虫(烟芽夜蛾)、烟草地老虎(斜纹夜蛾，也称为集群毛虫)、西部豆地老虎(西部豆角夜蛾)和天鹅绒豆毛虫(黎豆夜蛾)。
[0008]从历史上看，合成化学杀昆虫剂的密集应用依赖于在农业中作为害虫防治剂。对此类杀昆虫剂的无差别毒性作用的担忧、对环境和人类健康的担忧以及新出现的耐受性问题，都刺激了生物杀害虫剂的研究和开发。这项研究工作的结果是各种昆虫病原性微生物物种(包括细菌)的逐步发现和使用。
[0009]当昆虫病原性细菌，尤其是属于芽孢杆菌属(Bacillus)的细菌的潜力被发现并且
strategy and self
‑
limiting transgenic insects in resistance management—atest in experimental mesocosms.Evol Appl 11(5):727
–
738；Alphey等人2009.Combining pest control and resistance management:synergy of engineered insects with Bt crops.Journal of Economic Entomology,102:717
‑
732)。
[0013]因此，本专利技术人在本文中公开了一种来自苏云金芽孢杆菌的新型蛋白质和示例性重组蛋白质，它们各自表现出针对目标鳞翅目物种的杀昆虫活性，尤其是针对以下物种的杀昆虫活性：黑粘虫(考斯夜蛾)、黑地蚕(小地老虎)、玉米穗虫(玉米耳虫)、欧洲玉米螟(欧洲玉米螟)、秋粘虫(草地贪夜蛾)、南美豆荚虫(大豆荚虫)、南部行军虫(南部灰翅夜蛾)、大豆尺蠖(大豆尺蠖)、西南玉米螟(西南玉米螟)、甘蔗螟(小蔗螟)、向日葵尺蠖(薄荷灰夜蛾)、烟草蚜虫(烟芽夜蛾)和天鹅绒豆毛虫(黎豆夜蛾)。

技术实现思路

[0014]本文公开了一种具有昆虫抑制性活性的新型杀害虫性蛋白质TIC4029及其截短变体，所述蛋白质及其截短变体显示表现出针对作物植物的一种或多种害虫的抑制性活性。TIC4029蛋白毒素类中的TIC4029蛋白和变体蛋白可以单独使用或者与其他杀昆虫性蛋白质和毒剂组合用于制剂和植物体，从而为目前在农业系统中使用的杀昆虫性蛋白质和杀昆虫剂化学物质提供替代品。
[0015]在一个实施方案中，本申请公开了一种重组核酸分子，所述重组核酸分子包含异源性启动子，所述异源性启动子可操作地连接至编码杀害虫性蛋白质或其杀害虫性片段的多核苷酸区段，其中所述杀害虫性蛋白质包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:10的氨基酸序列；或者所述杀害虫性蛋白质包含与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列具有至少87％、或90％、或95％、或98％、或99％、或约100％同一性的氨基酸序列；或者所述多核苷酸区段在严格杂交条件下与具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:9中所示的核苷酸序列的多核苷酸杂交。所述重组核酸分子可以包含功能是在植物中表达所述杀害虫性蛋白质的序列，并且所述序列在植物细胞中表达时产生杀害虫有效量的杀害虫性蛋白质或其杀害虫性片段。
[0016]在本申请的另一个实施方案中，所述重组核酸分子存在于细菌或植物宿主细胞内。所设想的细菌宿主细胞包括至少以下属：农杆菌属(Agrobacterium)、根瘤菌属(Rhizobium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、埃希氏菌属(Escherichia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、泛菌属(Pantoea)和欧文氏菌属(Erwinia)。在某些实施方案中，所述芽孢杆菌属(Bacillus)是蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)或苏云金芽孢杆菌，所述短芽孢杆菌属(Brevibacillus)是侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)，或者所述埃希氏菌属(Escherichia)物种是大肠杆菌(Escherichia coli)。所设想的植物宿主细胞包括双子叶植物细胞和单子叶植物细胞。所设想的植物细胞还包括苜蓿、香蕉、大麦、豆、西兰花、卷心菜、芸苔、胡萝卜、木薯、蓖麻、花椰菜、芹菜、鹰嘴豆、白菜、柑橘、椰子、咖啡、玉米、三叶草、棉花(Gossypium sp.)、葫芦、黄瓜、道格拉斯冷杉、茄子、桉树、亚麻、大蒜、葡萄、啤酒花、韭葱、莴本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种重组核酸分子，所述重组核酸分子包含异源性启动子，所述异源性启动子可操作地连接至编码杀害虫性蛋白质或其杀害虫性片段的多核苷酸区段，其中，任选地：a.所述杀害虫性蛋白质包含SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列；b.所述杀害虫性蛋白质包含与SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:10中所示的氨基酸序列具有至少87％、或90％、或95％、或98％、或99％、或约100％同一性的氨基酸序列；或者c.所述多核苷酸区段在严格杂交条件下与具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ IDNO:8或SEQ ID NO:9中所示的核苷酸序列的多核苷酸杂交。2.如权利要求1所述的重组核酸分子：a.在植物细胞中表达以产生杀害虫有效量的所述杀害虫性蛋白质或杀害虫性片段；或者b.与载体可操作地连接，并且所述载体选自由以下组成的组：质粒、噬菌粒、杆粒、粘粒以及细菌或酵母人工染色体。3.如权利要求1所述的重组核酸分子，所述重组核酸分子存在于宿主细胞中，其中所述宿主细胞选自由细菌细胞和植物细胞组成的组。4.如权利要求3所述的重组核酸分子，其中所述细菌宿主细胞来自选自由以下组成的组的细菌属：农杆菌属、根瘤菌属、芽孢杆菌属、短芽孢杆菌属、埃希氏菌属、假单胞菌属、克雷伯氏菌属、泛菌属和欧文氏菌属。5.如权利要求4所述的重组核酸分子，其中所述芽孢杆菌是蜡样芽孢杆菌或苏云金芽孢杆菌，所述短芽孢杆菌属是侧孢短芽孢杆菌，并且所述埃希氏菌属是大肠杆菌。6.如权利要求2所述的重组核酸，其中所述植物细胞是双子叶植物细胞或单子叶植物细胞。7.如权利要求6所述的重组核酸，其中所述植物细胞选自由以下组成的组：苜蓿、香蕉、大麦、豆、西兰花、卷心菜、芸苔、胡萝卜、木薯、蓖麻、花椰菜、芹菜、鹰嘴豆、白菜、柑橘、椰子、咖啡、玉米、三叶草、棉花、葫芦、黄瓜、道格拉斯冷杉、茄子、桉树、亚麻、大蒜、葡萄、啤酒花、韭葱、莴苣、火炬松、小米、甜瓜、坚果、燕麦、橄榄、洋葱、观赏植物、棕榈、牧草、豌豆、花生、胡椒、木豆、松树、马铃薯、白杨、南瓜、辐射松、萝卜、油菜籽、水稻、砧木、黑麦、红花、灌木、高粱、南方松、大豆、菠菜、西葫芦、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甜玉米、枫香树、甘薯、柳枝稷、茶、烟草、番茄、黑小麦、草坪草、西瓜和小麦植物细胞。8.如权利要求1所述的重组核酸分子，其中所述蛋白质表现出针对鳞翅目昆虫的活性。9.如权利要求8所述的重组核酸分子，其中所述鳞翅目昆虫选自由以下组成的组：豆芽蛾(豆茎蛾)、黑粘虫(考斯夜蛾)、黑地蚕(小地老虎)、玉米穗虫(玉米耳虫)、欧洲玉米螟(欧洲玉米螟)、秋粘虫(草地贪夜蛾)、南美豆荚虫(大豆荚虫)、南部行军虫(南部灰翅夜蛾)、大豆尺蠖(大豆尺蠖)、西南玉米螟(西南玉米螟)、甘蔗螟(小蔗螟)、向日葵尺蠖(薄荷灰夜蛾)、烟草蚜虫(烟芽夜蛾)和天鹅绒豆毛虫(黎豆夜蛾)。10.一种包含如权利要求1所述的重组核酸分子的植物，或其一部分。11.如权利要求10所述的植物，其中所述植物是单子叶植物或双子叶植物，或其一部
分。12.如权利要求10所述的植物，其中所述植物选自由以下组成的组：苜蓿、香蕉、大麦、豆、西兰花、卷心菜、芸苔、胡萝卜、木薯、蓖麻、花椰菜、芹菜、鹰嘴豆、白菜、柑橘、椰子、咖啡、玉米、三叶草、棉花、葫芦、黄瓜、道格拉斯冷杉、茄子、桉树、亚麻、大蒜、葡萄、啤酒花、韭葱、莴苣、火炬松、小米、甜瓜、坚果、燕麦、橄榄、洋葱、观赏植物、棕榈、牧草、豌豆、花生、胡椒、木豆、松树、马铃薯、白杨、南瓜、辐射松、萝卜、油菜籽、水稻、砧木、黑麦、红花、灌木、高粱、南方松、大豆、菠菜、西葫芦、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、甜玉米、枫香树、甘薯、柳枝稷、茶、烟草、番茄、黑小麦、草坪草、西瓜和小麦。13.如权利要求10所述的植物，其中所述其一部分是种子，并且其中所述种子包含所述重组核酸分子。14.一种昆虫抑制性组合物，所述昆虫抑制性组合物包含如权利要求1所述的重组核酸分子。15.如权利要求14所述的昆虫抑制性组合物，其还包含编码不同于所述杀害虫性蛋白质或其杀害虫性片段的至少一种其他杀害虫剂的核苷酸序列。16.如权利要求15所述的昆虫抑制性组合物，其中所述至少一种其他杀害虫剂选自由以下组成的组：昆虫抑制性蛋白质、昆虫抑制性dsRNA分子、化学分子和辅助蛋白，并且其中所述至少一种其他杀害虫剂，与所述杀害虫性蛋白质或其杀害虫性片段相比，对相同的害虫具有毒性。17.如权利要求15所述的昆虫抑制性组合物，其中所述至少一种其他杀害虫剂表现出针对鳞翅目、鞘翅目或半翅目的一种或多种害虫物种的活性。18.如权利要求15所述的昆虫抑制性组合物，其中所述至少一种其他杀害虫性蛋白质选自由以下组成的组：Cry1A、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1A.105、Cry1Ae、Cry1B、Cry1C、Cry1C变体、Cry1D、Cry1E、Cry1F、Cry1A/F嵌合体、Cry1G、Cry1H、Cry1I、Cry1J、Cry1K、Cry1L、Cry2A、Cry2Ab、Cry2Ae、Cry3、Cry3A变体、Cry3B、Cry4B、Cry6、Cry7、Cry8、Cry9、Cry15、Cry34、Cry35、Cry43A、Cry43B、Cry51Aa1、ET29、ET33、ET34、ET35、ET66、ET70、TIC400、TIC407、TIC417、TIC431、TIC800、TIC807、TIC834、TIC853、TIC900、TIC901、TIC1201、TIC1415、TIC2160、TIC3131、TIC836、TIC860、TIC867、TIC869、TIC1100、VIP3A、VIP3B、VIP3Ab、AXMI
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AXMI
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97、AXMI
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102、AXMI
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112、AXMI
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117、AXMI
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100、AXMI
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【专利技术属性】
技术研发人员：D，
申请(专利权)人：孟山都技术公司，
类型：发明
国别省市：