一种大白菜初级三体系的培养方法技术

本发明专利技术公开了一种大白菜初级三体系的培养方法，属于利用细胞遗传学理论与育种技术领域。该方法包括（１）游离小孢子培养；（２）小孢子单株系的建立；（３）２ｎ＋１（三体）植株的筛选；（４）三体类别的鉴定；（５）三体植株标记性特征的确定。本发明专利技术的特点是：采用植物组织和细胞培养技术，对四倍体大白菜的游离小孢子进行离体培养，然后从培养获得的小孢子植株中直接进行初级三体的筛选和鉴定。利用本发明专利技术的方法创建初级三体，效率高，时间短，较常规的创建方法相比，创建一套初级三体，一般可缩短２－３年。利用本发明专利技术创建的一套大白菜初级三体可广泛用以大白菜的基因定位、遗传效应研究、染色体工程育种和分子工程育种等。

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种大白菜初级三体系的培养方法，属于利用细胞遗传学理论与育种

技术介绍
染色体是遗传物质——基因的载体。普通二倍体生物的染色体都是成对存在的，不同的生物种类有不同的染色体数目，如大白菜有10对染色体。若某对染色体多出1条额外染色体，则称为该对染色体的初级三体。某物种的各对染色体若均具有其初级三体，则成为该物种的初级三体系。初级三体系是用以基因定位的遗传材料，是分子遗传学和细胞遗传学研究相结合的特殊材料，在遗传和育种研究中具有十分重要的应用价值。初级三体系的选育是一项系统工程。目前，仅小麦、水稻、玉米、谷子、番茄等少数重要农作物创建成初级三体系。大白菜原产中国，国内外大白菜分子遗传学研究正在展开，目前尚没有初级三体材料，制约了分子细胞遗传学的深入开展。此外，在现有技术中，选育初级三体的方法均采用四倍体与二倍体杂交获得三倍体，然后用三倍体与二倍体进行回交，再从回交子代中进行筛选，该方法效率低、耗时长、工作量大，选育一套初级三体一般需要6-8年。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种快速培养大白菜初级三体系的方法，为开展大白菜分子细胞遗传学研究和大白菜育种奠定基础。本专利技术的基本原理是同源四倍体植物减数分裂不规则，除产生染色体数正常的2n小孢子外，还产生染色体数多一条的2n+1小孢子。细胞具有全能性，利用现代组织和细胞培养技术，2n小孢子、2n+1小孢子在适宜的培养基和培养条件下均可获得再生植株，从而直接获得三体植株。本专利技术的特点是采用植物组织和细胞培养技术，对四倍体大白菜的游离小孢子进行离体培养，然后从培养获得的小孢子植株中直接进行初级三体的筛选和鉴定。本专利技术包括以下步骤(1)游离小孢子培初花期一盛花期摘取花蕾，花蕾大小以小孢子单核靠边期为准；浅层培养法培养，小孢子密度3-5万/ml；基本培养基NLN(小孢子胚胎发生培养基)，附加蔗糖13％-17％，6-BA(6-苄氨基嘌呤)0.2ug/L，活性炭0.01g/L；首先于33℃预培养24小时(热激处理)后，继续在25℃下培养直至形成子叶形成熟胚；(2)小孢子单株系的建立培养基MS(幼苗生长培养基)，附加蔗糖30g/L，琼脂12g/L；子叶形胚接种到培养基上，通过腋芽增值和继代培养，使每个小孢子植株成为一个小孢子株系；(3)2n+1(三体)植株的筛选常规压片法，分别对各个小孢子株系进行染色体数目鉴定，选出2n+1＝21的(三体)株系；(4)三体类别的鉴定分别对选出的各个2n+1(三体)株系进行根尖染色体核型分析，依据染色体的大小、形态等表性特征，确定各2n+1(三体)株系的三体类别，并按染色体由长到短次序进行编号(如，1号三体、2号三体等)；(5)三体植株标记性特征的确定以正常的二倍体为对照，在相同的栽培管理条件下，对生殖生长阶段的植株进行详细的观察、测定、比较，分别找出各个不同三体的性状特征。具体地，本专利技术的培养方法详述如下以同源四倍体大白菜为材料，取小孢子为单核靠边时期的花蕾0.1％氯化汞消毒10分钟，无菌水冲洗4次，用玻璃棒压碎花蕾，使小孢子悬浮在B5培养液中，尼龙网过滤去除碎渣，离心洗涤3次，获得纯净小孢子，用NLN-15培养基(小孢子胚胎发生培养基)在培养皿中悬浮培养，每皿2ml，封口膜封口，置恒温培养箱中热激(33℃)培养24小时，然后在25℃下继续培养直至形成肉眼可见的子叶型胚，转入MS(幼苗生长培养基)固体培养基继续培养直至形成完整植株，利用根尖压片法进行染色体数目鉴定，选出染色体数目为2n+1＝21的三体植株，对选出的三体植株进行核型和带型分析，确定各三体植株的三体染色体类别(如1号三体、2号三体等)，田间种植观测，确定各三体的外部标记性特征。本专利技术取得的技术效果是利用该方法培养初级三体，效率高，时间短，较常规的创建方法相比，创建一套初级三体，一般可缩短2-3年。利用本专利技术创建的一套大白菜初级三体可广泛用以大白菜的基因定位、遗传效应研究、染色体工程育种和分子工程育种等。附图说明图1是大白菜9405初级三体系的检索表。具体实施例方式以下实施例用以说明本专利技术。实施例 以大白菜9405初级三体系的培养为例对本专利技术进行说明。原理说明同源四倍体大白菜9405减数分裂不规则，除产生染色体数正常的2n小孢子外，还产生染色体数多一条的2n+1小孢子。通过上述小孢子培养途径获得小孢子植株，进行染色体数目鉴定，从获得的小孢子植株选出136个2n+1的三体植株，通过核型和带型分析，从136个2n+1的三体植株中鉴定出了一整套初级三体(1号三体、2号三体、3号三体、4号三体、5号三体、6号三体、7号三体、8号三体、9号三体、10号三体)。具体培养方法同源四倍体大白菜9405为试材；于初花期至盛花期，取小孢子为单核靠边时期的花蕾，经0.1％氯化汞消毒10分钟、无菌水冲洗4次；在小烧杯中用玻棒压碎花蕾使小孢子悬浮在含蔗糖150g/L的B5培养液中，尼龙网过滤去除碎渣；滤液置离心管中，低速(1000转/分)离心使小孢子沉于底部，弃上清夜，加入新鲜培养液洗涤、离心，重复3次；最后用附加蔗糖150g/L、6-BA(6-苄氨基嘌呤)0.2ug/L、活性炭0.01g/L的NLN-15培养基(小孢子胚胎发生培养基)悬浮小孢子，血球计数板测定密度，使小孢子最终密度达到30000-50000个/ml；用吸管分装于直径为6cm的培养皿中，每皿2ml，封口膜封口；置恒温培养箱中热激(33℃)培养24小时，然后在25℃下继续培养直至形成子叶型胚；将子叶型胚转入含蔗糖30g/L、琼脂12g/L的MS固体培养基继续培养直至形成完整植株；根尖压片法对培养出的植株进行染色体数目鉴定，选出染色体数目为2n+1＝21的三体植株；对选出的2n+1＝21的三体植株进行核型和带型分析，根据染色体的大小、形态、着丝点的位置、随体的有无等表征，确定各三体植株的三体染色体类别(如1号三体、2号三体等)；田间种植观测，确定各个不同三体植株的外部标记性特征。该初级三体系的核型参数和植株表征如表1和检索表(检索表见图1)表1大白菜9405初级三体系的核型参数表本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种大白菜初级三体系的培养方法，其特征在于对四倍体大白菜的游离小孢子进行离体培养，然后从培养获得的小孢子植株中直接进行初级三体的筛选和鉴定，包括以下步骤：（１）游离小孢子培养初花期－盛花期摘取花蕾，花蕾大小以小孢子单核靠边期 为准；浅层培养法培养，小孢子密度３－５万／ｍｌ；基本培养基ＮＬＮ（小孢子胚胎发生培养基），附加：蔗糖１３％－１７％，６－ＢＡ（６－苄氨基嘌呤）０．２ｕｇ／Ｌ，活性炭０．０１ｇ／Ｌ；首先于３３℃预培养２４小时（热激处理）后，继续在２５℃下培养直至形成子叶形成熟胚；（２）小孢子单株系的建立培养基ＭＳ（幼苗生长培养基），附加：蔗糖３０ｇ／Ｌ，琼脂１２ｇ／Ｌ；子叶形胚接种到培养基上，通过腋芽增值和继代培养，使每个小孢子植株成为一个小孢子株系；（３）２ｎ＋１（三 体）植株的筛选常规压片法，分别对各个小孢子株系进行染色体数目鉴定，选出２ｎ＋１＝２１的（三体）株系；（４）三体类别的鉴定分别对选出的各个２ｎ＋１（三体）株系进行根尖染色体核型分析，依据染色体的大小、形态等表性特征，确 定各２ｎ＋１（三体）株系的三体类别，并按染色体由长到短次序进行编号；（５）三体植株标记性特征的确定以正常的二倍体为对照，在相同的栽培管理条件下，对生殖生长阶段的植株进行详细的观察、测定、比较，分别找出各个不同三体的性状特征。...

【技术特征摘要】
CN 2005-5-18 20051001251921.一种大白菜初级三体系的培养方法，其特征在于对四倍体大白菜的游离小孢子进行离体培养，然后从培养获得的小孢子植株中直接进行初级三体的筛选和鉴定，包括以下步骤(1)游离小孢子培养初花期—盛花期摘取花蕾，花蕾大小以小孢子单核靠边期为准；浅层培养法培养，小孢子密度3-5万/ml；基本培养基NLN(小孢子胚胎发生培养基)，附加蔗糖13％-17％，6-BA(6-苄氨基嘌呤)0.2ug/L，活性炭0.01g/L；首先于33℃预培养24小时(热激处理)后，继续在25℃下培养直至形成子叶形成熟胚；(2)小孢子单株系的...

【专利技术属性】
技术研发人员：申书兴，张成合，陈焕英，陈雪平，李晓峰，王彦华，
申请(专利权)人：河北农业大学，
类型：发明
国别省市：13[中国|河北]