一种镍离子人工抗原螯合剂的合成及镍单克隆抗体的制备。以４－硝基邻苯二胺为原料经过一系列反应化学合成了６－溴乙酰氨基－２，３－（Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′－四乙酸）二甲胺基喹喔啉，简称ＢＡＴＤＱ，作为合成镍人工抗原的双功能螯合剂，利用ＢＡＴＤＱ的四乙酸和溴乙酰氨基结构螯合镍离子及载体蛋白质，获得人工抗原。然后通过人工抗原免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，并运用细胞融合、细胞克隆等技术获得对应于镍的单克隆抗体，用于检测环境、食品中镍的残留。本发明专利技术具有快速、灵敏、成本低、特别适合大批量现场快速检测的特点，并且本发明专利技术中的镍人工抗原制备方法简单，成本低，而单克隆抗体的制备技术相对比较成熟，便于规模化生产，检测技术简单，易于推广。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种新的双功能螯合剂及该螯合剂在重金属镍 离子人工抗原的合成及镍单克隆抗体制备中的应用。
技术介绍
人工抗原的合成是重金属免疫分析技术中关键环节之一，它 是利用双功能螯合剂先与重金属离子形成稳定的螯合物(半抗原 分子)，再与载体蛋白质偶联形成重金属-螯合剂-载体蛋白质的螯 合物(人工抗原)。目前双功能螯合剂的种类非常少，并且价格偏 高，阻碍了重金属人工抗原合成的研究。本申请人曾在先申请了 镉离子人工抗原螯合剂的合成方法，继而介绍了对应的镉离子人工抗原和单克隆抗体的合成，并将抗体应用于镉离子污染的检测， 但对于重金属镍而言，目前国内并没有关于制备其人工抗原的相 关报道，因此，寻找新型、价廉的双功能螯合剂，并进一步制备 相应的人工抗原和单克隆抗体，对应用于重金属镍残留污染的快 速检测具有十分重要的现实意义。
技术实现思路
针对现有技术的上述不足，本专利技术的目的是研制出 一种双功能的镍离子人工抗原螯合剂6-溴乙酰氨基-2， 3-(N， N， N'， N'-四乙酸)二曱胺基会鬼啉(6-bromine acetamido-2， 3-(N， N， N'， N'- tetraacethyl) dimethylamino-quinoxaline， BATDQ)合成 对应于重金属镍的人工抗原，并公开基于此人工抗原的重金属镍 单克隆抗体的制备方法，以及运用酶联免疫吸附法(Enzymeassay, EIJSA)中的间接竟争法检观J富 含镍离子污染的样品。本专利技术的目的通过如下措施实现l.镍离子人工抗原螫合剂的合成方法如下1) 6-硝基-2， 3-二甲基喹喔啉的合成将2 g 4-硝基邻苯二胺和1. 13 g 丁二酮放入250 mL单口烧 瓶中，以50mL无水乙醇为溶剂，加热回流2h，冷却至室温后抽 滤，加30 mL无水乙醇结晶提纯，所得产物即为6-硝基-2， 3-二甲基喹喔啉；2) 6-硝基-2， 3-二溴甲基会喔啉的合成取0. 5 g第一步产物6-硝基-2， 3-二曱基喹喔啉、0.202 g 偶氮二异丁腈与1.14 g N-溴代琥珀酰亚胺置于干燥的250 mL单 口圆底烧瓶中，再取40 mL四氯化碳加入烧瓶中，装上回流冷凝 管，抽真空并用氩气保护，将烧瓶置于事先加热到80。C的油浴中， 强力搅拌，并用火焰枪辅助加热使之快速回流，待反应完毕后， 将混合物冷却至室温再过滤，取滤液放入水浴锅中蒸馏、冷却， 得6-硝基-2， 3-二溴甲基喹喔啉；3) 6-硝基-2， 3-(N, N， N'， N'-四乙酸)二甲胺基喹喔啉的 合成在装有机械搅拌、回流冷凝管和恒压漏斗的三口烧瓶中，加 入l. 99 mL亚氛基二乙酸二乙酯、10 mL干燥的乙腈和2. 63 g无 水碳酸钾粉末；搅拌下向反应混合液中滴加溶有1.805 g 6-硝基 -2, 3-二溴曱基会喔啉的10 mL干燥乙腈，回流8-10 h，冷却， 滤去碳酸钾，滤液减压下旋转蒸发回收溶剂，得淡黄色油状液体；往上述油状液中加入含3. 48 g结晶氢氧化钡(Ba (OH) 2 8H20 )的 饱和溶液，室温下充分搅拌至油状液体均转化为白色沉淀，抽滤 钡盐并用蒸馏水充分浸泡、洗涤；然后将此钡盐转移到15 mL蒸 馏水中，将混合物加热煮沸，加入石克酸至清液中不再出现混浊， 过滤除去硫酸钡，再用沸水煮洗硫酸钡残渣3次，将滤液和洗涤 液合并，冰箱中冷却8-10h，得到6-硝基-2， 3-(N， N， N'， N'-四乙酸)二曱胺基喹喔啉；4) 6-氨基-2，3-(N， N，『，N'-四乙酸)二甲胺基喹喔啉的合成将IOO mL乙醇和2.025 g 6-硝'基-2， 3-(N, N， N'， N'-四乙 酸)二曱胺基喹喔啉加入到250 mL装有温度计、机械搅拌器的三 口瓶中，加入1. 2 g钯碳催化剂和5. 29 g水合肼，不断搅拌，在 80-85n条件下反应4 h后，趁热过滤，滤液经减压蒸去乙醇，冷 却后所得固体用50mL苯重结晶，得到6-氨基-2，3-(N， N， N'， N'-四乙酸)二曱胺基会喔啉；5) 6-溴乙酰氨基-2, 3-(N， N， N'，『-四乙酸)二曱胺基喹 喔啉的合成取5. 05 g溴乙酰溴溶于30 mL三氯化碳中，2.105 g碳酸氬 钠溶于100 mL水中，冰浴中将碳酸氢钠溶液緩慢滴加到溴乙酰溴 溶液中，取18. 722 g 6-氨基-2，3-(N， N， N'， N'-四乙酸)二曱胺 基喹喔啉装入三口烧瓶中，温度保持在50-60lC，快速搅拌的同时 把溴乙酰溴和碳酸氢钠混合液緩慢地滴入6-氨基-2， 3-(N， N， N: N'-四乙酸)二甲胺基喹喔啉中，并用氢氧化钠溶液控制反应体系 的pH为12.0，滴加完毕，升温到90X:，搅拌，将溶剂全部蒸出，加入50 mL浓盐酸，过滤分离出氯化钠，然后往盐酸提取液中加 入150 mL无水乙醇，产生白色沉淀，4。C存放8-10 h，用50%的 乙醇水溶液重结晶，得6-溴乙酰氨基-2， 3-(N, N， N', N'-四乙 酸)二甲胺基喹喔啉；2. 镍人工抗原的合成包括下列步骤1) 重金属镍半抗原的合成取BATDQ 0. 8 mg，用pH=7. 5，浓度为0. 1 mol L—i的磷酸盐 緩沖液(Phosphate buffered saline, PBS)定容至2 mL，加 入O. 4 mg的硝酸镍，搅拌使其混合均匀，反应30 min;2) 重金属镍人工抗原的合成将5 mg牛血清白蛋白(Bovine serum albumin, BSA)用pH=9. 6 的PBS定容至2mL，室温下，将其緩慢加入半抗原溶液中，并用 氢氧化钾调节pH-9. 5，室温下搅拌反应20h，即得重金属镍人工 抗原；3) 重金属镍包被抗原的合成将5 mg人血清白蛋白(Human serum albumin, HSA)用pH=9. 6 的PBS定容至2mL，室温下，将其緩慢加入半抗原溶液中，并用 氢氧化钾调节pH-9. 5，室温下搅拌反应20h，即得重金属镍包被 抗原；3. 镍单克隆抗体制备包括下列步骤 1)小鼠免疫及抗血清制备选用6周龄雌性BALB/c小鼠8只，将人工抗原与佐剂按1:1 体积比混合，注射器双推法使其混合均匀，初次免疫将人工抗原 与完全佐剂乳化，腹腔、皮下、颈部多点注射，每只小鼠注射0.2mL，第一次免疫3周后进行第二次免疫，剂量和途径同第一次， 但从第二次免疫开始佐剂换用不完全佐剂，每隔两周分别进行第 三次、第四次免疫，第四次免疫后采血清，检测效价，取效价高 的继续加强免疫，加强免疫时抗原不加任何佐剂；加强免疫3天后，摘眼#小鼠血液于灭菌的康氏管内，室 温放置lh，在超净工作台用无菌管把血块和管壁剥离，37。C恒温 2h后，41C冰箱中静置8-10 h，使血清充分析出，收集血清，将 血清IOOO rpm/min离心10 min，收集上清，将血清分装， 保存；2)间接ELISA法检测抗血清效价包被用pH=9. 6，浓度为0. 05 mol . L—i的碳酸盐緩沖液将包 被抗原稀释至2 )Lig'mL—、 100 inL/孔，包被到酶标板上，4。C反 应12 h或37"C水浴3 h;洗涤倾去板孔液，用pH=7. 4,浓度本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种镍离子人工抗原螯合剂的合成方法，其特征包括下列步骤： １）６－硝基－２，３－二甲基喹喔啉的合成： 将２ｇ ４－硝基邻苯二胺和１．１３ｇ丁二酮放入２５０ｍＬ单口烧瓶中，以５０ｍＬ无水乙醇为溶剂，加热回流２ｈ，冷却至室温后抽滤 ，加３０ｍＬ无水乙醇结晶提纯，所得产物即为６－硝基－２，３－二甲基喹喔啉； ２）６－硝基－２，３－二溴甲基喹喔啉的合成： 取０．５ｇ第一步产物６－硝基－２，３－二甲基喹喔啉、０．２０２ｇ偶氮二异丁腈与１．１４ｇ Ｎ－溴代琥珀酰 亚胺置于干燥的２５０ｍＬ单口圆底烧瓶中，再取４０ｍＬ四氯化碳加入烧瓶中，装上回流冷凝管，抽真空并用氩气保护，将烧瓶置于事先加热到８０℃的油浴中，强力搅拌，并用火焰枪辅助加热使之快速回流，待反应完毕后，将混合物冷却至室温再过滤，取滤液放入水浴锅中蒸馏、冷却，得６－硝基－２，３－二溴甲基喹喔啉； ３）６－硝基－２，３－（Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′－四乙酸）二甲胺基喹喔啉的合成： 在装有机械搅拌、回流冷凝管和恒压漏斗的三口烧瓶中，加入１．９９ｍＬ亚氨基二乙酸二乙酯、１０ｍＬ干燥 的乙腈和２．６３ｇ无水碳酸钾粉末；搅拌下向反应混合液中滴加溶有１．８０５ｇ ６－硝基－２，３－二溴甲基喹喔啉的１０ｍＬ干燥乙腈，回流８－１０ｈ，冷却，滤去碳酸钾，滤液减压下旋转蒸发回收溶剂，得淡黄色油状液体；往上述油状液中加入含３．４８ｇ 结晶氢氧化钡的饱和溶液，室温下充分搅拌至油状液体均转化为白色沉淀，抽滤钡盐并用蒸馏水充分浸泡、洗涤； 然后将此钡盐转移到１５ｍＬ蒸馏水中，将混合物加热煮沸，加入硫酸至清液中不再出现混浊，过滤除去硫酸钡，再用沸水煮洗硫酸钡残渣３次，将滤 液和洗涤液合并，冰箱中冷却８－１０ｈ，得到６－硝基－２，３－（Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′－四乙酸）二甲胺基喹喔啉； ４）６－氨基－２，３－（Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′－四乙酸）二甲胺基喹喔啉的合成： 将１００ｍＬ乙醇和２．０２５ｇ ６－硝基－ ２，３－（Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′－四乙酸）二甲胺基喹喔啉加入到２５０ｍＬ装有温度计、机械搅拌器的三口瓶中，加入１．２ｇ钯碳催化剂和５．２９ｇ水合肼，不断搅拌，在８０－８５℃条件下反应４ｈ后，趁热过滤，滤液经减压蒸去乙醇，冷却后所得固体用５０ｍＬ苯重结晶，得到６－氨基－２，３－（Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′－四乙酸）二甲胺基喹喔啉； ５）６－溴乙酰氨基－２，３－（Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郭明，车晓青，姚嘉赟，刘力，
申请(专利权)人：浙江林学院，
类型：发明
国别省市：33[中国|浙江]
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