稳定化的TCR构建体及使用方法技术

稳定化的TCR构建体，其包含具有可变α(Vα)结构域和恒定α(Cα)结构域的TCRα链多肽和具有可变β(Vβ)结构域和恒定β(Cβ)结构域的TCRβ链多肽。通过向Cα结构域和/或Cβ结构域中引入稳定化突变来稳定TCR构建体，所述稳定化突变诸如在Cα结构域和Cβ结构域之间的非天然存在的二硫键(链间二硫键)、非天然存在的链内二硫键、点突变、环截短突变及其组合。还描述了包含一个或多个TCR构建体和支架和/或其他生物活性部分的TCR融合蛋白。或其他生物活性部分的TCR融合蛋白。或其他生物活性部分的TCR融合蛋白。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】稳定化的TCR构建体及使用方法


[0001]本公开涉及用作治疗剂的可溶性T细胞受体的领域，并且尤其涉及稳定的TCR构建体和TCR融合蛋白。

技术介绍

[0002]T细胞受体(TCR)是T细胞表面上存在的蛋白质。TCR通过与细胞表面上存在的I类和II类主要组织相容性复合物(MHC)结合来调节免疫响应。呈递经由TCR激活T细胞的肽序列的MHC会触发免疫响应。在癌症的情况下，经突变或过表达的肽序列可以呈递在癌细胞的表面上。TCR可以区分具有单个氨基酸突变的肽，并从而提供特异性靶向这些突变肽
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MHC复合物的机会。
[0003]TCR属于蛋白质的免疫球蛋白超家族(IgSF)并与抗体具有某些结构相似性。类似于抗体的Fab部分，TCR包括两条独特的链，每条链含有一个可变结构域和一个恒定结构域，该可变结构域中的高度可变环(CDR)提供TCR的结合选择性。
[0004]TCR是含有跨膜结构域的膜结合蛋白。人们对开发可溶性形式的TCR作为治疗剂一直感兴趣，但是可溶性TCR是具有低表达和低稳定性的固有不稳定蛋白。已经描述了提高可溶性TCR的稳定性的修饰。国际专利公开号WO 2004/074322描述了一种稳定化的可溶性TCR，其在恒定结构域残基之间包含不存在于天然TCR中的二硫键。国际专利公开号WO 2016/070814描述了一种高稳定性的可溶性TCR，其包含连接TCRα和β链的恒定结构域的人工链间二硫键，并且国际专利公开号WO 2016/184258描述了一种稳定化的可溶性异源二聚体TCR，其在α链可变区和β链恒定区之间含有人工链间二硫键。也已经描述了改善可溶性TCR的稳定性的点突变(参见，Shusta等人，2000，Nature Biotechnol.，18：754
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759，和Gunnarsen等人，2013，Scientific Reports，3：1162)。
[0005]TCR胞外部分与人免疫球蛋白(Ig)的不同结构域融合也已经被用作增加TCR的表达和/或改善其稳定性的策略(参见，Lunde等人，2010，BMC Biotechnol.，10：61；Ozawa等人2012，Biochem.Biophys.Res.Commun.，422：245
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249；和Wu等人，2015，MAbs，7：364
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376)。
[0006]国际专利公开号WO 1999/018129描述了一种单链TCR(sc
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TCR)，其中TCR的α链和β链以柔性接头连接。经证实sc
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TCR具有改善的稳定性。还描述了sc
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TCR融合蛋白，其包括与免疫球蛋白轻链恒定区融合的共价连接的TCR Vα链和Vβ链。美国专利号6,534,633和8，105,830描述了通过肽接头序列共价连接到至少一种单链抗体(sc
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Ab)的sc
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TCR。
[0007]提供该背景信息的目的在于使申请人相信的已知信息成为与本公开可能相关的信息。不一定旨在承认，也不应该解释为，任何前述信息构成了针对所要求保护的专利技术的现有技术。

技术实现思路

[0008]本文描述了稳定化的TCR构建体及使用方法。在一方面，本公开涉及一种TCR构建体，其包含TCRα链多肽和TCRβ链多肽，所述TCRα链多肽包含可变α(Vα)结构域和恒定α(Cα)
结构域并且所述TCRβ链多肽包含可变β(Vβ)结构域和恒定β(Cβ)结构域，其中所述Cα结构域和Cβ结构域包含：稳定化突变，所述稳定化突变包含在所述Cα结构域和所述Cβ结构域之间的第一链间二硫键；和一个或多个额外的稳定化突变，所述一个或多个额外的稳定化突变选自：a)在以下两者之间形成的链间二硫键：i)由所述TCRβ链多肽的所述Cβ结构域的C端的氨基酸延伸所包含的半胱氨酸残基，其中所述氨基酸延伸的长度为1至约10个氨基酸，和ii)所述TCRα链多肽的所述Cα结构域中的位置TRAC 128的半胱氨酸残基；b)在位置TRAC 84.2和TRBC 79处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；c)在位置TRAC 122和TRBC 12处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；d)在位置TRAC 124和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；e)在位置TRAC 125和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；f)在位置TRAC 126和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；g)在位置TRAC 127和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；h)在位置TRAC 128和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；i)在位置TRAC 39和TRAC 85处的半胱氨酸残基取代之间的链内二硫键；j)在位置TRAC 26和TRAC 85.1处的半胱氨酸残基取代之间的链内二硫键；k)在位置TRAC 4处从Val到Ala、Thr、Ile、Leu或Met的氨基酸取代；l)在位置TRAC 26处从Thr到Ala、Val、Ile、Leu或Met的氨基酸取代；m)在位置TRAC 39处从Val到Ala、Thr、Ile、Leu或Met的氨基酸取代；n)在位置TRAC 85处从Ala到Ser、Thr、Val、Ile或Met的氨基酸取代；o)在位置TRAC 105处从Ala到Ser、Thr、Glu、Gln、Asp、Asn、His、Lys或Arg的氨基酸取代；p)在位置TRAC 120处从Phe到Tyr或His的氨基酸取代；q)在位置TRBC 6处从Val到Ala、Thr、Ile、Leu或Met的氨基酸取代；r)在位置TRBC 36处从His到Phe、Tyr或Trp的氨基酸取代；s)在位置TRBC 86处从Ser到Ala或Thr的氨基酸取代；t)在位置TRBC 45.3处从Val到Ser、Thr、Glu、Gln、Asp、Asn、His、Lys或Arg的氨基酸取代；u)所述TCR构建体的所述Cβ结构域中所述DE环的1至4个连续氨基酸的缺失，以及v)2至4个氨基酸的氨基酸序列置换位置TRBC 84.4至85.4处的氨基酸，其中所述氨基酸序列允许形成β
‑
转角，其中氨基酸的编号是IMGT编号，并且其中与仅包含第一非天然存在的二硫键的相应TCR构建体相比，所述TCR构建体具有增加的TCR解链温度(Tm)。
[0009]在另一方面，本公开涉及一种TCR构建体，其包含TCRα链多肽和TCRβ链多肽，所述TCRα链多肽包含可变α(Vα)结构域和恒定α(Cα)结构域并且所述TCRβ链多肽包含可变β(Vβ)结构域和恒定β(Cβ)结构域，其中所述Cα结构域和Cβ结构域包含一个或多个选自以下的稳定化突变：a)在以下两者之间形成的链间二硫键：i)由所述TCRβ链多肽的所述Cβ结构域的C端的氨基酸延伸所包含的半胱氨酸残基，其中所述氨基酸延伸的长度为1至约10个氨基酸，和ii)所述TCRα链多肽的所述Cα结构域中的位置TRAC 128的半胱氨酸残基；b)在位本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种TCR构建体，其包含TCRα链多肽和TCRβ链多肽，所述TCRα链多肽包含可变α(Vα)结构域和恒定α(Cα)结构域并且所述TCRβ链多肽包含可变β(Vβ)结构域和恒定β(Cβ)结构域，其中所述Cα结构域和Cβ结构域包含：稳定化突变，所述稳定化突变包含在所述Cα结构域和所述Cβ结构域之间的第一链间二硫键；和一个或多个额外的稳定化突变，所述一个或多个额外的稳定化突变选自：a)在以下两者之间形成的链间二硫键：i)由所述TCRβ链多肽的Cβ结构域的C端处的氨基酸延伸所包含的半胱氨酸残基，其中所述氨基酸延伸的长度为1至约10个氨基酸，和ii)所述TCRα链多肽的Cα结构域中的位置TRAC 128处的半胱氨酸残基；b)在位置TRAC 84.2和TRBC 79处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；c)在位置TRAC 122和TRBC 12处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；d)在位置TRAC 124和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；e)在位置TRAC 125和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；f)在位置TRAC 126和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；g)在位置TRAC 127和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；h)在位置TRAC 128和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；i)在位置TRAC 39和TRAC 85处的半胱氨酸残基取代之间的链内二硫键；j)在位置TRAC 26和TRAC 85.1处的半胱氨酸残基取代之间的链内二硫键；k)在位置TRAC 4处从Val到Ala、Thr、Ile、Leu或Met的氨基酸取代；l)在位置TRAC 26处从Thr到Ala、Val、Ile、Leu或Met的氨基酸取代；m)在位置TRAC 39处从Val到Ala、Thr、Ile、Leu或Met的氨基酸取代；n)在位置TRAC 85处从Ala到Ser、Thr、Val、Ile或Met的氨基酸取代；o)在位置TRAC 105处从Ala到Ser、Thr、Glu、Gln、Asp、Asn、His、Lys或Arg的氨基酸取代；p)在位置TRAC 120处从Phe到Tyr或His的氨基酸取代；q)在位置TRBC 6处从Val到Ala、Thr、Ile、Leu或Met的氨基酸取代；r)在位置TRBC 36处从His到Phe、Tyr或Trp的氨基酸取代；s)在位置TRBC 86处从Ser到Ala或Thr的氨基酸取代；t)在位置TRBC 45.3处从Val到Ser、Thr、Glu、Gln、Asp、Asn、His、Lys或Arg的氨基酸取代；u)所述TCR构建体的Cβ结构域中所述DE环的1至4个连续氨基酸的缺失，和v)2至4个氨基酸的氨基酸序列置换位置TRBC 84.4至85.4处的氨基酸，其中所述氨基酸序列允许形成β
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转角，其中氨基酸的编号是IMGT编号，并且其中与仅包含第一非天然存在的二硫键的相应TCR构建体相比，所述TCR构建体具有增加的TCR解链温度(Tm)。2.根据权利要求1所述的TCR构建体，其中所述第一链间二硫键选自：a)在以下两者之间形成的链间二硫键：i)由所述TCRβ链多肽的Cβ结构域的C端处的氨基酸延伸所包含的半胱氨酸残基，其中所述氨基酸延伸的长度为1至约10个氨基酸，和ii)
所述TCRα链多肽的Cα结构域中的位置TRAC 128处的半胱氨酸残基；b)在位置TRAC 84和TRBC 79处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；c)在位置TRAC 84.2和TRBC 79处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；d)在位置TRAC 122和TRBC 12处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；e)在位置TRAC 124和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；f)在位置TRAC 125和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；g)在位置TRAC 126和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；h)在位置TRAC 127和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；以及i)在位置TRAC 128和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键，并且其中所述第一个链间二硫键和任何额外的链间二硫键是不同的。3.根据权利要求1所述的TCR构建体，其中所述第一链间二硫键选自：a)在以下两者之间形成的链间二硫键：i)由所述TCRβ链多肽的Cβ结构域的C端的氨基酸延伸所包含的半胱氨酸残基，其中所述氨基酸延伸的长度为1至约10个氨基酸，和ii)所述TCRα链多肽的Cα结构域中的位置TRAC 128处的半胱氨酸残基；b)在位置TRAC 84和TRBC 79处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；和c)在位置TRAC 84.2和TRBC 79处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键，并且其中所述第一个链间二硫键和任何额外的链间二硫键是不同的。4.根据权利要求1所述的TCR构建体，其中所述第一链间二硫键选自：a)在以下两者之间形成的链间二硫键：i)由所述TCRβ链多肽的Cβ结构域的C端处的氨基酸延伸所包含的半胱氨酸残基，其中所述氨基酸延伸的长度为1至约10个氨基酸，和ii)所述TCRα链多肽的Cα结构域中的位置TRAC 128处的半胱氨酸残基；和b)在位置TRAC 84.2和TRBC 79处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键，并且其中所述第一个链间二硫键和任何额外的链间二硫键是不同的。5.根据权利要求1至4中任一项所述的TCR构建体，其中所述一个或多个额外的稳定化突变包含选自以下的额外的链间二硫键：a)在以下两者之间形成的链间二硫键：i)由所述TCRβ链多肽的Cβ结构域的C端的氨基酸延伸所包含的半胱氨酸残基，其中所述氨基酸延伸的长度为1至约10个氨基酸，和ii)所述TCRα链多肽的Cα结构域中的位置TRAC 128处的半胱氨酸残基；b)在位置TRAC 84.2和TRBC 79处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；c)在位置TRAC 122和TRBC 12处的半胱氨酸残基取代之间的二硫键；d)在位置TRAC 124和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的二硫键；e)在位置TRAC 125和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的二硫键；f)在位置TRAC 126和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的二硫键；g)在位置TRAC 127和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的二硫键；以及h)在位置TRAC 128和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的二硫键。6.根据权利要求1所述的TCR构建体，其中所述第一非天然存在的链间二硫键是在位置TRAC 84.2和TRBC 79处的半胱氨酸残基取代之间的二硫键。7.根据权利要求6所述的TCR构建体，其中所述一个或多个额外的稳定化突变包含选自以下的额外的链间二硫键：
a)在以下两者之间形成的链间二硫键：i)由所述TCRβ链多肽的Cβ结构域的C端的氨基酸延伸所包含的半胱氨酸残基，其中所述氨基酸延伸的长度为1至约10个氨基酸，和ii)所述TCRα链多肽的Cα结构域中的位置TRAC 128处的半胱氨酸残基；b)在位置TRAC 122和TRBC 12处的半胱氨酸残基取代之间的二硫键；c)在位置TRAC 124和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的二硫键；d)在位置TRAC 125和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的二硫键；e)在位置TRAC 126和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的二硫键；f)在位置TRAC 127和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的二硫键；以及g)在位置TRAC 128和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的二硫键。8.根据权利要求1至7中任一项所述的TCR构建体，其中所述TCRβ链多肽的Cβ结构域的C端处的所述氨基酸延伸长度为5个氨基酸或更少。9.根据权利要求1至8中任一项所述的TCR构建体，其中所述TCRβ链多肽的Cβ结构域的C端处的所述氨基酸延伸包含IgG1上部铰链区的序列的全部或一部分。10.根据权利要求9所述的TCR构建体，其中所述氨基酸延伸包含序列：EPKSC[SEQ ID NO:19]。11.根据权利要求9所述的TCR构建体，其中所述氨基酸延伸包含序列：EPKSCDKTHT[SEQ ID NO:16]。12.根据权利要求1至11中任一项所述的TCR构建体，其中所述一个或多个额外的稳定化突变包含选自以下的链内二硫键：在位置TRAC 39和TRAC 85处的半胱氨酸残基取代之间的链内二硫键；和在位置TRAC 26和TRAC 85.1处的半胱氨酸残基取代之间的链内二硫键。13.根据权利要求1至12中任一项所述的TCR构建体，其中所述一个或多个额外的稳定化突变包括：a)在位置TRAC 26处从Thr到Ala、Val、Ile、Leu或Met的氨基酸取代；b)在位置TRAC 85处从Ala到Ser、Thr、Val、Ile或Met的氨基酸取代；c)在位置TRBC 6处从Val到Ala、Thr、Ile、Leu或Met的氨基酸取代；和d)在位置TRBC 36处从His到Phe、Tyr或Trp的氨基酸取代。14.一种TCR构建体，其包含TCRα链多肽和TCRβ链多肽，所述TCRα链多肽包含可变α(Vα)结构域和恒定α(Cα)结构域并且所述TCRβ链多肽包含可变β(Vβ)结构域和恒定β(Cβ)结构域，其中所述Cα结构域和/或Cβ结构域包含一个或多个选自以下的稳定化突变：a)在以下两者之间形成的链间二硫键：i)由所述TCRβ链多肽的Cβ结构域的C端处的氨基酸延伸所包含的半胱氨酸残基，其中所述氨基酸延伸的长度为1至约10个氨基酸，和ii)所述TCRα链多肽的Cα结构域中的位置TRAC 128处的半胱氨酸残基；b)在位置TRAC 84.2和TRBC 79处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；c)在位置TRAC 124和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；d)在位置TRAC 125和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；e)在位置TRAC 126和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；f)在位置TRAC 127和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；
g)在位置TRAC 128和TRBC 11处的半胱氨酸残基取代之间的链间二硫键；h)在位置TRAC 39和TRAC 85处的半胱氨酸残基取代之间的链内二硫键；i)在位置TRAC 26和TRAC 85.1处的半胱氨酸残基取代之间的链内二硫键；j)在位置TRAC 4处从Val到Ala、Thr、Ile、Leu或Met的氨基酸取代；k)在位置TRAC 26处从Thr到Ala、Val、Ile、Leu或Met的氨基酸取代；l)在位置TRAC 39处从Val到Ala、Thr、Ile、Leu或Met的氨基酸取代；m)在位置TRAC 85处从Ala到Ser、Thr、Val、Ile或Met的氨基酸取代；n)在位置TRAC 105处从Ala到Ser、Thr、Glu、Gln、Asp、Asn、His、Lys或Arg的氨基酸取代；o)在位置TRAC 120处从Phe到Tyr或His的氨基酸取代；p)在位置TRBC 6处从Val到Ala、Thr、Ile、Leu或Met的氨基酸取代；q)在位置TRBC 36处从His到Phe、Tyr或Trp的氨基酸取代；r)在位置TRBC 86处从Ser到Ala或Thr的氨基酸取代；s)在位...

【专利技术属性】
技术研发人员：E，
申请(专利权)人：酵活生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：