本发明专利技术公开了甘蓝型油菜BnaTT10基因及其突变体的制备与应用，通过CRISPR/Cas9基因编辑技术靶向敲除BnaTT10基因的3个同源拷贝BnaTT10.A06、BnaTT10.A02和BnaTT10.C02，获得了BnaTT10基因突变的甘蓝型油菜突变体，研究发现三纯合突变体株系的成熟种子种皮变黄、变薄且木质素含量减少，成熟种子的含油量也显著升高，因此可将BnaTT10基因应用于油菜育种中以改良油菜种子性状，具有巨大的应用潜力和前景，为油菜品质育种提供了新的种质资源。为油菜品质育种提供了新的种质资源。为油菜品质育种提供了新的种质资源。
【技术实现步骤摘要】
甘蓝型油菜BnaTT10基因及其突变体的制备与应用
[0001]本专利技术属于油菜分子育种
，具体涉及甘蓝型油菜BnaTT10基因及其突变体的制备与应用。
技术介绍
[0002]油菜是我国第五大作物、第一大油料作物，常年种植面积约1.2亿亩，年生产“最健康的大宗食用植物油”菜籽油500多万吨，约占我国食用植物油的55％，同时可提供800多万吨的饲料饼粕。此外，油菜营养体可用作蔬菜和绿肥；油菜花具有观赏价值，也可作为蜜源应用于生产。
[0003]籽粒颜色是甘蓝型油菜的重要性状之一。相比黑籽，黄籽种皮变薄、皮壳率降低、种皮中木质素含量降低、含油量和蛋白含量增加；因此，黄籽的出油率更高，而且饼粕的营养价值也会提高。由于种皮中花青素含量减少，黄籽在榨油时加工过程更为简单，不仅节约了加工成本，还可以减少营养物质的流失。虽然在白菜型油菜和芥菜型油菜中均有较多的黄籽自然资源，但甘蓝型油菜还没有发现天然的黄籽材料。研究者们通过远缘杂交成功获得了甘蓝型黄籽油菜，但黄籽度不高，且黄籽表型易受环境影响，选育效率低，育种周期长，而且可能存在不利的连锁累赘。由于甘蓝型油菜是我国生产上种植的最主要的类型，因此在甘蓝型油菜中鉴定黄籽重要功能基因、研究其形成的调控机理、并创建黄籽种质资源，将具有很大的应用价值及前景。
技术实现思路
[0004]本专利技术的目的在于提供甘蓝型油菜BnaTT10基因及其突变体的制备与应用。本专利技术通过CRISPR/Cas9基因编辑技术靶向敲除BnaTT10基因的3个同源拷贝(BnaTT10.A06、BnaTT10.A02和BnaTT10.C02)，并获得了BnaTT10基因突变的甘蓝型油菜突变体，研究发现，三纯合突变体株系的成熟种子种皮变黄、变薄且木质素含量减少，同时含油量也显著升高，因此可将BnaTT10基因应用于油菜育种中以改良油菜种子性状，具有巨大的应用潜力和前景，为油菜品质育种提供了新的种质资源。
[0005]为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：
[0006]本专利技术的目的之一在于提供甘蓝型油菜BnaTT10基因，所述BnaTT10基因包括3个同源拷贝基因，分别为：如SEQ ID NO.1所示的BnaTT10.A06基因、如SEQ ID NO.2所示的BnaTT10.A02基因，以及如SEQ ID NO.3所示的BnaTT10.C02基因。
[0007]进一步地，所述BnaTT10.A06基因的cDNA序列如SEQ ID NO.4所示，所述BnaTT10.A02基因的cDNA序列如SEQ ID NO.5所示，BnaTT10.C02基因的cDNA序列如SEQ ID NO.6所示。
[0008]本专利技术的目的之二在于提供一种甘蓝型油菜黄籽突变体的制备方法，所述突变体由所述3个同源拷贝基因同时发生基因编码区内的突变获得。
[0009]进一步地，利用CRISPR/CAS9技术敲除所述3个同源拷贝基因。
[0010]进一步地，包括以下步骤：
[0011]步骤一：获取所述BnTT10基因片段；
[0012]步骤二：针对所述BnTT10基因的核苷酸序列设计sgRNA，并以sgRNA为靶序列，分别设计合成正向和反向寡核苷酸序列，退火形成双链，制成Oligo二聚体，将所述Oligo二聚体与Cas9载体连接，构建得到植物表达载体；
[0013]步骤三：将步骤二中构建的表达载体转化至甘蓝型油菜株系中，获得转基因油菜植株；
[0014]步骤四：对转基因油菜植株进行检测，确定基因型；
[0015]步骤五：转基因油菜植株自交，获得BnaTT10.A06基因、BnaTT10.A02基因以及BnaTT10.C02基因被同时敲除的三纯合突变体。
[0016]进一步地，所述sgRNA包括：
[0017]特异性靶向甘蓝型油菜BnaTT10.A02基因的sgRNA1，其核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；
[0018]特异性靶向BnaTT10.C02基因的sgRNA3，其核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；
[0019]特异性靶向甘蓝型油菜BnaTT10.A06基因的sgRNA2和sgRNA4，其核苷酸序列分别如SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.21所示。
[0020]进一步地，所述寡核苷酸序列包括：
[0021]根据sgRNA1设计的寡核苷酸序列sgRNA1
‑
F和sgRNA1
‑
R如SEQ ID NO.22
‑
23所示；
[0022]根据sgRNA2设计的寡核苷酸序列sgRNA2
‑
F和sgRNA2
‑
R如SEQ ID NO.24
‑
25所示；
[0023]根据sgRNA3设计的寡核苷酸序列sgRNA3
‑
F和sgRNA3
‑
R如SEQ ID NO.26
‑
27所示；
[0024]根据sgRNA4设计的寡核苷酸序列sgRNA4
‑
F和sgRNA4
‑
R如SEQ ID NO.28
‑
29所示。
[0025]进一步地，步骤二中采用pYLCRISPR/Cas9多重基因组靶向载体系统构建所述植物表达载体。
[0026]进一步地，步骤三中将建的表达载体转化至半冬性甘蓝型油菜纯系J9707中。
[0027]本专利技术的目的之三在于提供所述甘蓝型油菜BnaTT10基因在油菜育种中的应用。
[0028]本专利技术的目的之四在于提供所述甘蓝型油菜黄籽突变体的制备方法在油菜育种中的应用。
[0029]进一步地，所述油菜育种包括：甘蓝型油菜黄籽、薄种皮、种子高含油量方面的育种。
[0030]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术利用CRISPR/Cas9技术靶向BnaTT10的3个同源基因(BnaTT10.A06、BnaTT10.A02和BnaTT10.C02)，通过遗传转化和突变体后代筛选获得了不含T
‑
DNA插入的三拷贝纯合突变体，并对这些突变体表型鉴定及品质分析。研究发现，BnaTT10基因的三拷贝纯合突变体可以产生黄籽表型，种皮变薄，种皮木质素含量降低，含油量也显著增加。因此可将BnaTT10基因应用于油菜育种中以改良油菜种子性状，具有巨大的应用潜力和前景，为油菜品质育种提供新的种质资源。
附图说明
[0031]图1为本专利技术实施例中BnaTT10的基因结构图及利用CRISPR/CAS9技术构建的载体图；
[0032]图2为本专利技术实施例中转化植株T3代三纯合突变体TT10
‑
1、TT10
‑
13和TT10
‑
43的sgRNA1
‑
4位点核苷酸；
[0033]图3为本专利技术实施例中野生型和BnaTT10突变体的表型图，图3本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.甘蓝型油菜BnaTT10基因，其特征在于，所述BnaTT10基因包括3个同源拷贝基因，分别为：如SEQ ID NO.1所示的BnaTT10.A06基因、如SEQ ID NO.2所示的BnaTT10.A02基因，以及如SEQ ID NO.3所示的BnaTT10.C02基因。2.根据权利要求1所述的甘蓝型油菜BnaTT10基因，其特征在于，所述BnaTT10.A06基因的cDNA序列如SEQ ID NO.4所示，所述BnaTT10.A02基因的cDNA序列如SEQ ID NO.5所示，BnaTT10.C02基因的cDNA序列如SEQ ID NO.6所示。3.一种甘蓝型油菜黄籽突变体的制备方法，其特征在于，所述突变体由如权利要求1所述的3个同源拷贝基因同时发生基因编码区内的突变获得。4.根据权利要求3所述的甘蓝型油菜黄籽突变体的制备方法，其特征在于，利用CRISPR/CAS9技术敲除所述3个同源拷贝基因。5.根据权利要求4所述的甘蓝型油菜黄籽突变体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一：获取如权利要求1所述的BnTT10基因片段；步骤二：针对所述BnTT10基因的核苷酸序列设计sgRNA，并以sgRNA为靶序列，分别设计合成正向和反向寡核苷酸序列，退火形成双链，制成Oligo二聚体，将所述Oligo二聚体与Cas9载体连接，构建得到植物表达载体；步骤三：将步骤二中构建的表达载体转化至甘蓝型油菜株系中，获得转基因油菜植株；步骤四：对转基因油菜植株进行检测，确定基因型；步骤五：转基因油菜植株自交，获得BnaTT10.A06基因、BnaTT10.A02基因以及BnaTT10.C02基因被同时敲除的三纯合突变体。6.根据权利要求5所述的甘蓝型油菜黄籽突变体的制备方法，其特征在于，所述sgRNA包括：特异性靶向甘蓝型...
【专利技术属性】
技术研发人员：范楚川，李淮琳，何菡子，余凯迪，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：
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