一种评估零模波导孔有效载样的方法及其应用技术

本发明专利技术公开一种评估零模波导孔有效载样的方法，包括：制备酶

【技术实现步骤摘要】
一种评估零模波导孔有效载样的方法及其应用


[0001]本专利技术属于基因测序
，具体涉及一种评估零模波导孔有效载样的方法及其应用。

技术介绍

[0002]科学家们对于遗传物质的早期探索是艰难而又缓慢的，从发现遗传物质的存在，到确认DNA是遗传物质并提出DNA双螺旋模型，经历了近一个世纪的探索。19世纪60年代，孟德尔提出分离定律和自由组合定律；直到1953年，沃森和克里克提出了DNA双螺旋模型，人们才对DNA的形态才有了初步的认知。而在这之后，对于DNA的研究进入了飞速发展的阶段。1987年启动的人类基因组计划，完成了30亿个碱基对的测序，总共花了6个国家13年的时间。而2023年的今天，一个完整的基因组测序，从采样到测序到分析，只需要花费一周的时间。这一切，都得益于基因测序技术的诞生和迭代。
[0003]自从20世纪70年代一代测序技术问世以来，基因测序技术在几十年间不断发展，已经形成了各具特色的几代测序方法。其中一代测序有两种代表性的方法，分别是链终止法，也常被称为Sanger测序法，以及化学裂解法。一代测序的准确率可达99.999％，一次可以读取600
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1000bp左右的碱基，直到现在，仍然是行业内的金标准，但一代测序的通量低，成本高。这也促进了二代测序的诞生，二代测序以大规模高通量平行测序为主要特征，准确率能够超过99.9％，高通量使得DNA的测序成本大幅下降，研究显示，2007年至2012年，DNA测序单个碱基的原始成本下降了四个数量级。罗氏、Illimina、赛默飞等二代测序公司展开了激烈的竞争，成本的下降及商业上的推广使得二代测序成为当前市场上的主流使用方法。但同时由于二代测序读长短，且需要进行模板扩增，所以在过程中会引入复制错误、酶的偏好性、GC bias、算法的偏好性等系统性偏差，使得二代测序对于一些结构变异、重复性序列等信息的检测准确性不够。而三代测序则能够很好地处理这些问题。三代测序以单分子测序为主要特征，读长可达100kb，逐渐成为当前研究的热点以及未来测序发展的主要趋势。三代测序主要分为纳米孔测序技术和单分子实时测序技术(SMRT)；单分子实时测序技术(SMRT)是三代测序中应用比较广泛且已经大规模商业化的核心技术。
[0004]SMRT测序技术的核心在于使用磷酸位标记的dNTP搭配直径在50
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200nm的零模波导孔(ZMW)形成分散在各个孔内的单分子荧光，利用单分子荧光实时显示DNA聚合的反应过程，再使用单分子荧光成像系统进行观察、捕获和分析。在这个过程中有效载样是实现单分子实时测序的必要条件，有效载样率及ZMW数量决定了测序通量。为了保证测序过程的顺利进行，进孔的样本需要同时满足以下几个条件：
[0005](1)孔内含有酶
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引物
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模板三元复合物，而不仅仅是单个酶分子、单个引物分子、单个引物
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模板二元复合物分子；
[0006](2)单个酶
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引物
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模板三元复合物进孔且固定在孔底，而不是空的孔、双复合物分子孔或多复合物分子孔；
[0007](3)整体过程中保证酶活性，确保后续滚环复制顺利进行。
[0008]为了提高ZMW的单分子载样，现有的一些技术包括：直接提高ZMW数量、借助磁场或电场的辅助、改变DNA结构等。例如最新的Revio系统中，ZMW数量达到了2500万，单独提高ZMW的数量只能提高载样孔的数目而不能改善载样的比例；利用磁珠辅助酶
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引物
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模板三元复合物分子载样，相比自由扩散的方法载样效率高，但只适合片段较短的文库；利用电场辅助载样，是通过对芯片进行改造，在每个ZMW中形成电场，有助于带有负电荷的三元复合物进孔，但芯片改造进一步拉高了成本而且纳米级别的制造工艺困难。另外还有一些通过改变DNA构型来辅助载样的方法，例如通过DNA折纸技术将单链线性DNA的形状变成方形或圆形，使其更容易进入ZMW中；利用亚精胺等DNA凝聚剂改变DNA构型辅助进孔等。为了确认以上方法是否能够增加单分子实时测序中的有效载样，需要进行评估，但是现有的评估方法无法满足单分子实时测序中评估有效载样的需求：首选在现有的评估ZMW载样的方法中，使用的模型都是单纯的单链或者双链DNA，在评估过程中，仅以DNA分子作为观测对象，通过荧光淬灭的阶梯数来判断ZMW孔内的DNA分子个数，即只考察了孔内分子的数目。而单分子实时测序环境下，除了三元复合物的数目，还需要考察三元复合物的反应活性，以便验证后续滚环复制能否顺利进行；其次，现有评估方法的溶液体系过于单一，与单分子实时测序的溶液体系有较大偏差。在ZMW孔常见的使用案例中，使用的溶液体系往往只含有一种物质，目标分子的干扰因素较少。而单分子实时测序环境下，溶液体系内除了三元复合物分子，还存在多种其他分子，如单个单种分子、二元复合物分子等，干扰因素较多，如果评估时使用的溶液体系及模型过于简单，则会带来较大的偏差；此外，在单分子实时测序过程中，缺少针对载样这一中间步骤有效的评估方法。实际测序中，对于有效载样的评估往往需要通过后验证的方法，即在采样、提取DNA及质检、构建文库及质检、上机测序、下机数据处理与分析的测序流程之后，才能对本次有效载样的情况进行统计、评估与分析，整体需要消耗来之不易的样本、需要较高的实验条件和水准、需要花费将近一周的时间，对于载样这样一个测序的中间步骤来说，研究的时间和金钱成本都很高。
[0009]综上所述，现有的评估方法往往由于溶液体系和模型的限制，仅关注和评估ZMW孔内的分子个数，而无法评估孔内的反应活性；而且溶液体系及模型与实际测序情况存在较大偏差，无法满足单分子实时测序中评估有效载样的需求。

技术实现思路

[0010]因此，本专利技术要解决的技术问题在于现有技术中关于单分子实时测序的载样这一步骤，没有特定且简易的方法对有效载样进行较为准确的评估及判定这一缺陷，从而提供一种评估零模波导孔有效载样的方法及其应用。
[0011]为此，本专利技术采用如下技术方案：
[0012]本专利技术提供一种评估零模波导孔有效载样的方法，包括如下步骤：
[0013]S1：制备酶
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引物
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模板三元复合物；
[0014]S2：将三元复合物和芯片绑定；
[0015]S3:对芯片进行荧光淬灭，并对荧光淬灭过程进行拍摄，找到具有单个荧光的孔；
[0016]S4：添加启动试剂，启动聚合反应，对芯片进行荧光累积，并对荧光累积结果进行拍摄，找到荧光能够持续累积的孔；
[0017]S5：确定荧光淬灭阶段具有单个荧光，且荧光累积阶段荧光能够持续累积的孔为
有效载样孔。
[0018]进一步地，步骤S1中的酶
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引物
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模板三元复合物中所述模板为单链环形模板，具体制备方法包括：
[0019]合成长度50～140nt的单链DNA模板，序列中A本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种评估零模波导孔有效载样的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1：制备酶
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引物
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模板三元复合物；S2：将三元复合物和芯片绑定；S3:对芯片进行荧光淬灭，并对荧光淬灭过程进行拍摄，找到具有单个荧光的孔；S4：添加启动试剂，启动聚合反应，对芯片进行荧光累积，并对荧光累积结果进行拍摄，找到荧光能够持续累积的孔；S5：确定荧光淬灭阶段具有单个荧光，且荧光累积阶段荧光能够持续累积的孔为有效载样孔。2.根据权利要求1所述的评估零模波导孔有效载样的方法，其特征在于，步骤S1中的酶
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引物
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模板三元复合物中所述模板为单链环形模板，具体制备方法包括：合成长度50～140nt的单链DNA模板，序列中A、T、C、G四种碱基中的一种碱基的数量只有一个，其余碱基的数量大于一；使用环化酶或T4 DNA连接酶对所述单链DNA模板进行环化，并进行纯化，得到所述单链环形模板。3.根据权利要求1或2所述的评估零模波导孔有效载样的方法，其特征在于，步骤S1中，酶
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引物
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模板三元复合物的制备方法为将单链环形模板与带有荧光和固定基团的引物进行退火处理，形成引物
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环形模板复合物；然后添加phi29聚合酶孵育得到所述酶
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引物
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模板三元复合物。4.根据权利要求3所述的评估零模波导孔有效载样的方法，其特征在于，所述引物上的固定基团包括但不限于生物素、链霉亲和素、氨基中的至少一种；荧光包括但不限于香豆素系...

【专利技术属性】
技术研发人员：张威，王璐，郭振，周连群，李金泽，姚佳，李传宇，张芷齐，李超，杨弃，
申请(专利权)人：中国科学院苏州生物医学工程技术研究所，
类型：发明
国别省市：