番茄抗黄化曲叶病毒病育种的分子标记辅助选择方法技术

本发明专利技术公开了番茄抗黄化曲叶病毒病育种的分子标记辅助选择方法，属于蔬菜抗病育种技术领域。该方法按以下步骤进行：（１）从育种分离世代材料提取ＤＮＡ；（２）筛选抗ＴＹＬＣＶＤ基因的ＳＣＡＲ分子标记；（３）ＤＮＡ的双重ＰＣＲ扩增与电泳分析检测；（４）依据检测结果对育种分离世代材料进行抗性评价。本发明专利技术可在实验室对育种进程中的任何世代材料，对其是否聚合抗ＴＹＬＣＶ的基因进行准确、快速的检测，从而明显缩短了抗病育种的周期，缩小了育种规模，并具有操作简便、省时、省力、省成本等优点，减少了工作量，提高了对抗性材料的筛选效率，加快了抗病育种进程。该发明专利技术可在番茄育种单位推广应用。

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
番茄抗黄化曲叶病毒病育种的分子标记辅助选择方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：　（１）从育种分离世代材料提取ＤＮＡ：将番茄抗黄化曲叶病毒病育种分离世代材料的种子，播种；待幼苗长至３～４片真叶时，每植株取１片幼叶，用改进的ＣＴＡＢ法提 取ＤＮＡ；　（２）筛选抗ＴＹＬＣＶＤ基因的ＳＣＡＲ分子标记：根据已发表的文献资料，初选出抗番茄黄化曲叶病毒病基因的分子标记，合成引物后进行ＰＣＲ扩增；并根据ＰＣＲ扩增的纯合和杂合带型以及人工苗期接种鉴定结果，从中筛选出适合自己育种材料 的抗番茄黄化曲叶病毒病基因Ｔｙ－２和Ｔｙ－３的ＳＣＡＲ分子标记；Ｔｙ－２上、下游引物的序列分别如ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．１和ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．２所示，Ｔｙ－３上、下游引物的序列分别如ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．３和ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ．４所示；　 （３）双重ＰＣＲ反应体系的建立与电泳分析检测：Ｔｙ－２和Ｔｙ－３基因的双重ＰＣＲ反应体系为：扩增反应的总体积为１０微升，０．７μＬ　ＤＮＡ模板，０．２μＬ　１０ｍｍｏｌ.Ｌ↑［－１］ｄＮＴＰｓ，５０ｎｇ.μＬ↑［－１］的Ｔｙ－２上、下游引物各０．１２５μＬ，５０ｎｇ.μＬ↑［－１］的Ｔｙ－３上、下游引物各０．１２５μＬ，１μＬ含２０ｍｍｏｌ.Ｌ↑［－１］Ｍｇ２＋的１０×反应缓冲液，２Ｕ.μＬ↑［－１］的Ｔａｑ酶０．２５μＬ，无菌纯水７．３５μＬ；ＰＣＲ反应程序为：９４℃２ｍｉｎ预变性后，接着９４℃变性３０ｓ，５４℃复性１ｍｉｎ，７２℃延伸１ｍｉｎ，４０个扩增循环，最后７２℃延伸１０ｍｉｎ；ＰＣＲ产物于１．２％琼脂糖凝胶上进行电泳分离分析、ＥＢ染色，在Ｂｉｏ－ＲＡＤ凝胶成像系统上自动成像；　（４）依据检测结 果对育种分离世代材料抗性的评价：依据成像对育种分离世代材料抗性进行评价，若扩增条带中含有９００ｂｐ和／或４５０ｂｐ大小的ＤＮＡ条带，则该材料中含有抗番茄黄化曲叶病毒病的Ｔｙ－２和／或Ｔｙ－３基因；若反之，则该材料中没有Ｔｙ－２和／或Ｔｙ－３基因。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：叶青静，杨悦俭，王荣青，周国治，阮美颖，李志邈，姚祝平，
申请(专利权)人：浙江省农业科学院，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]