一种单管检测多靶标的荧光PCR方法及其应用技术

本发明专利技术涉及生物检测技术领域，特别涉及一种单管检测多靶标的荧光PCR方法及其应用。该荧光PCR方法，扩增反应结束后，根据软件采集并分析得到的扩增曲线平台期荧光值的高度，判读区分各检测靶基因。该荧光PCR方法通过扩增曲线的平台荧光值差异，区分不同病原体，可实现单管单个荧光通道的多靶标检测，当靶标数量超过仪器设备的荧光通道数量时，还可采用单管多个荧光通道的多靶标检测，检测更多靶标，成本低、耗时短，具有普适性。具有普适性。具有普适性。

【技术实现步骤摘要】
一种单管检测多靶标的荧光PCR方法及其应用


[0001]本专利技术涉及生物检测
，特别涉及一种单管检测多靶标的荧光PCR方法及其应用。

技术介绍

[0002]荧光PCR法指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定性或定量分析的方法。根据其使用的荧光物质，可以分为染料法和荧光探针法。荧光PCR法检测多个靶标或多个病原体，目前常用的方法有以下几种：
[0003](1)多色荧光溶解曲线：如公告号为CN103290115B的中国专利技术专利公开了一种利用MLPA对肺炎链球菌进行血清型分型的方法，以MLPA通用扩增引物PCR扩增已杂交并连接好的MLPA探针，使用多色荧光溶解曲线分析PCR产物，实现对肺炎链球菌进行血清型分型。在PCR反应结束后，对PCR产物进行溶解曲线分析，根据溶解曲线特征波峰位置所对应的Tm值，区分检测的靶标，以此实现单通道所靶标的检测。该方法结合荧光PCR仪的多色通道，可实现多色多靶标的检测。
[0004]但多色荧光溶解曲线的方法是在PCR结束后，进行溶解曲线分析，主要依靠PCR产物Tm值、溶解曲线的特征峰来区分不同的靶标，对仪器温控要求相对较高，且耗时长。
[0005](2)微流控：通过微流控的技术，在耗材和设备上增加反应孔数实现检测多靶标，该方法耗时短。
[0006]但微流控技术，耗材成本较高，且需要使用专用设备，成本相对较高。此外，使用微流控技术，试剂保存及耗材存放都需要更多的保护措施，有些甚至还需使用冻干微球技术，增加了试剂成本。
[0007](3)探针或分子信标荧光PCR法：针对所要检测的靶标，设计一套特异性检测的引物探针，根据所用仪器的通道数量，在探针上标记不同的荧光基团，每个荧光通道对应一个检测靶标，根据仪器所具备的荧光通道数量，可以检测相应数量的靶标，该方法耗时较短，成本较微流控技术低。
[0008]但探针或分子信标荧光PCR法检测多靶标时，通常需要使用到多个荧光通道，当检测的靶标数量超过仪器设备的荧光通道数量时，则需要多管联合检测，使得仪器检测通量下降。从结果判读角度来看，多管多通道的荧光PCR方法进行多靶标联合检测容易出现混淆或误判的情况。从试剂成本角度来看，使用多管多通道的荧光PCR方法多靶标联合检测，由于使用多管，例如酶、dNTPs等存在多管的成本，综合成本依然较高。
[0009]因此，如何在单管下检测多个靶标成为了荧光PCR法进一步改进的关键。

技术实现思路

[0010]为了克服上述现有技术的缺陷，本专利技术所要解决的技术问题是提供一种单管检测多靶标的荧光PCR方法及其应用。
[0011]为了解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：一种单管检测多靶标的荧光PCR方法，扩增反应结束后，根据软件采集并分析得到的扩增曲线平台期荧光值的高度，判读区分各检测靶基因。
[0012]本专利技术采用的另一技术方案为：上述单管检测多靶标的荧光PCR方法在定性分析和定量分析上的应用。
[0013]本专利技术的有益效果在于：本专利技术的荧光PCR方法，在各方面均具有优势：
[0014](1)判读结果上，可避免多管的孔间联合判读导致的误判；
[0015](2)耗时上，不使用溶解曲线或其他产物分析方法，耗时与荧光PCR相同；
[0016](3)成本上，本专利技术的荧光PCR方法使用的为单管，大大节省了多管，例如酶、dNTPs等扩增试剂原料的使用量，成本较低。
[0017]本专利技术的单管检测多靶标的荧光PCR方法可用于定性，也可用于定量分析，定量分析时需增加一组标准物质，根据Ct值及标准物质的浓度绘制标准曲线，既可实现对所检测病原体的定量。
附图说明
[0018]图1所示为本专利技术实施例一的荧光PCR扩增曲线图；
[0019]图2所示为本专利技术实施例二的荧光PCR扩增曲线图；
[0020]图3所示为本专利技术实施例二中合胞和肺支的荧光PCR扩增曲线图；
[0021]图4所示为本专利技术实施例二中甲流、乙流和偏肺的荧光PCR扩增曲线图。
具体实施方式
[0022]为详细说明本专利技术的
技术实现思路
、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。
[0023]本专利技术最关键的构思在于：通过扩增曲线的平台荧光值差异，区分不同病原体。
[0024]本专利技术的一种单管检测多靶标的荧光PCR方法，扩增反应结束后，根据软件采集并分析得到的扩增曲线平台期荧光值的高度，判读区分各检测靶基因。
[0025]从上述描述可知，本专利技术的有益效果在于：Taqman探针(水解探针)或分子信标的荧光PCR法检测多靶标时通常采用单管多个荧光通道，当Taqman探针或分子信标的荧光PCR法检测的靶标数量超过仪器设备的荧光通道数量时，则需要多管联合检测，不仅检测成本高，还会使得仪器检测通量下降。
[0026]本专利技术的荧光PCR方法通过扩增曲线的平台荧光值差异，区分不同病原体，可实现单管单个荧光通道的多靶标检测，当靶标数量超过仪器设备的荧光通道数量时，还可采用单管多个荧光通道的多靶标检测，检测更多靶标。
[0027]本专利技术的荧光PCR方法，在各方面均具有优势：
[0028](1)判读结果上，可避免多管的孔间联合判读导致的误判；
[0029](2)耗时上，不使用溶解曲线或其他产物分析方法，耗时与荧光PCR相同；
[0030](3)成本上，本专利技术的荧光PCR方法使用的为单管，大大节省了多管，例如酶、dNTPs等扩增试剂原料的使用量，成本较低。
[0031]进一步地，本专利技术的单管检测多靶标的荧光PCR方法为单通道检测或多通道检测。
[0032]进一步地，为单通道检测，具体包括以下步骤：
[0033]S1：根据待测的靶基因的特异性序列，分别设计并合成引物和探针；
[0034]S2：进行PCR反应体系配制及扩增；
[0035]S3：扩增反应结束后，根据软件采集并分析得到的扩增曲线平台期荧光值的高度，判读区分各检测靶基因。
[0036]从上述描述可知，使用荧光平台期进行判读主要的技术障碍在于两点，一是基于现有标准的荧光PCR反应体系，扩增效率及空间差异会导致相同样本相同反应条件下平台高度不同。二是受标准PCR体系影响固有的思维定式，认为Ct值的应用更具有重复性，平台荧光值比较分散。
[0037]本专利技术的单通道检测通过调整PCR反应体系中各试剂的使用量，使得各个浓度梯度的核酸模板经过PCR循环扩增后，平台期都能达到基本一致的荧光信号。然后通过调整PCR反应体系中加入的不同靶标的特异性探针的量，使得不同靶标的平台期荧光信号值有明显的差异，区分检测的靶标，从而实现单色多靶标的检测。
[0038]本专利技术的荧光PCR方法不用使用专用耗材和专用设备，对设备无特殊要求，所用的耗材及设备均为实验室常见的荧光PCR仪及反应管。相比目前多靶标检测的其他方法，本方案使用的为单管多靶本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种单管检测多靶标的荧光PCR方法，其特征在于，扩增反应结束后，根据软件采集并分析得到的扩增曲线平台期荧光值的高度，判读区分各检测靶基因。2.根据权利要求1所述的单管检测多靶标的荧光PCR方法，其特征在于，为单通道检测，具体包括以下步骤：S1：根据待测的靶基因的特异性序列，分别设计并合成引物和探针；S2：进行PCR反应体系配制及扩增；S3：扩增反应结束后，根据软件采集并分析得到的扩增曲线平台期荧光值的高度，判读区分各检测靶基因。3.根据权利要求2所述的单管检测多靶标的荧光PCR方法，其特征在于，所述探针的5
’
端均标记相同的荧光标记，3
’
端标记相同的淬灭基团。4.根据权利要求2所述的单管检测多靶标的荧光PCR方法，其特征在于，所述PCR反应体系包括PCRBuffer、引物探针混合液、DEPC水、核酸模板和酶混合液。5.根据权利要求2所述的单管检测多靶标的荧光PCR方法，其特征在于，所述PCRBuffer、引物探针混合液、DEPC水、核酸模板和酶混合液的体积比为25：10：20～23：20：3～5。6.根据权利要求2所述的单管检测多靶标的荧光PCR方法，其特征在于，所述探针的加入量的确认方法为：先进行探针加入量的梯度...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄海峰，李晓燕，洪炯志，蔡晓沂，
申请(专利权)人：泰普生物科学中国有限公司，
类型：发明
国别省市：