本发明专利技术属于基因工程技术领域，公开了一株高产磷脂酰丝氨酸的酿酒酵母工程菌株，所述酿酒酵母工程菌株是在酿酒酵母宿主菌中过表达SEQ ID NO.1所示的YML115C基因所得，YML115C基因所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术所构建的酿酒酵母工程菌株在发酵24h后，磷脂酰丝氨酸含量达到7.94mg/gDCW，是野生型菌株的4.36倍。本发明专利技术所述工程菌株不但磷脂酰丝氨酸产量得到了提高，发酵条件较为简单，降低投资成本，具有广阔的应用前景。具有广阔的应用前景。具有广阔的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
一株高产磷脂酰丝氨酸的酿酒酵母工程菌株、构建方法及应用
[0001]本专利技术属于基因工程
，涉及酿酒酵母工程菌株的构建及其应用，尤其是一株高产磷脂酰丝氨酸的酿酒酵母工程菌株、构建方法及应用。
技术介绍
[0002]磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)又称丝氨酸磷脂、二酰甘油酰磷酸丝氨酸，简称PS，是存在于细菌、酵母、植物、哺乳动物细胞中的一种重要的膜磷脂。磷脂酰丝氨酸(PS)是一种新资源食品，在制药和功能食品领域具有广泛的应用，能够改善老年人的阿尔茨海默病，具有保护神经和抗氧化作用，还具有提高记忆力、缓解紧张、减轻抑郁等功效，为“脑专一性营养物质”。
[0003]PS的制备方法主要有提取法、化学合成法和酶转化法。提取法是以动植物组织为原料，利用化学溶剂提取PS的方法，通常以大豆或动物的大脑及内脏作为原料，提取得到的磷脂酰丝氨酸纯度较低且含量较少，由于有机溶剂的大量使用，提取获得的磷脂酰丝氨酸的安全性无法保证，且提取成本过高；化学法合成PS是利用磷酸二酯键将甘油的2
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C位和3
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C位上的
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OH与L
‑
丝氨酸连接形成中间化合物，然后将中间化合物进行酯化、氧化反应，之后再脱保护基即得到产品PS。化学合成法工艺流程繁琐，需要的成本较高。生物酶转化法是以自然界中含量高的磷脂酰胆碱和亲核试剂L
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丝氨酸为原料，利用磷脂酶D的转酰基反应生成PS。相比于传统的提取法，生物酶催化法具有简单高效、反应条件温和、产率高等优势，但由于该反应为酶促反应，需要考虑不同的反应体系来促使该反应顺利的进行。
[0004]随着对酿酒酵母基因组测序的完成，对其生理特性和代谢调控机制越来越深入和全面的了解，酿酒酵母已成为越来越多科学技术人员所青睐的微生物细胞工厂搭建所用底盘生物。目前已有很多的具有极高医药用价值的产品、食品原材料、工业原料等，可以利用酿酒酵母工程菌株进行量产。目前，磷脂酰丝氨酸产品的市场需求量巨大，市场需求日益增长。因此，基于以上调研分析，本领域迫切需要开发一种可高效生产磷脂酰丝氨酸的酵母菌株。
[0005]通过检索，尚未发现与本专利技术专利申请相关的专利公开文献。
技术实现思路
[0006]本专利技术的目的在于克服现有技术上存在的问题，提供一株高产磷脂酰丝氨酸的酿酒酵母工程菌株、构建方法及应用。
[0007]本专利技术解决技术问题所采用的技术方案是：
[0008]一株高产磷脂酰丝氨酸的酿酒酵母工程菌株，所述酿酒酵母工程菌株是在酿酒酵母宿主菌中过表达SEQ ID NO.1所示的YML115C基因所得，YML115C基因所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0009]进一步地，所述工程菌株在构建时采用表达载体pRS426，过表达SEQ ID NO.1所示
的YML115C基因；
[0010]其中，所述酿酒酵母宿主菌为酿酒酵母菌株Saccharomyces cerevisiae BY4743。
[0011]如上所述的高产磷脂酰丝氨酸的酿酒酵母工程菌株的构建方法，所述方法包括以下步骤：
[0012]在酿酒酵母菌株Saccharomyces cerevisiae BY4743中过表达SEQ ID NO.1所示的YML115C基因。
[0013]进一步地，所述工程菌株在构建时构建了包含myc
‑
HA标签的YML115C融合基因。
[0014]进一步地，具体步骤如下：
[0015](1)根据SEQ ID NO.1所示的YML115C基因的核苷酸序列设计引物，构建带有myc
‑
HA标签的YML115C基因过表达的重组质粒；
[0016](2)对步骤(1)构建的重组质粒采用醋酸锂转化法导入酿酒酵母菌株Saccharomyces cerevisiae BY4743中进行表达；
[0017](3)在尿嘧啶营养缺陷型固体培养基上进行筛选，在尿嘧啶营养缺陷型固体培养基上生长出的单菌落，即为高产磷脂酰丝氨酸的酿酒酵母工程菌株。
[0018]进一步地，每1L尿嘧啶营养缺陷型固体培养基为：酵母氮源基础6.5
‑
7g/L，灭菌结束后加入尿嘧啶缺陷型氨基酸混合物(DO Supplement
–
Ura)0.72
‑
0.84g/L和葡萄糖1.7
‑
2.3％，琼脂2
‑
3％，用ddH2O定容至1L；
[0019]其中，上述百分数均为质量浓度百分数。
[0020]如上所述的高产磷脂酰丝氨酸的酿酒酵母工程菌株在磷脂酰丝氨酸生产中的应用。
[0021]利用如上所述的酿酒酵母工程菌株发酵生产磷脂酰丝氨酸的方法，步骤如下：
[0022]将高产磷脂酰丝氨酸的酿酒酵母工程菌株通过三区划线涂布于尿嘧啶营养缺陷型固体培养基平板上，25～30℃培养48
‑
72h，将活化后的菌种，接1
‑
2环于装有3
‑
5mL尿嘧啶营养缺陷型液体培养基中，25～30℃，180
‑
220rpm条件下培养12
‑
20h即为种子培养液，将种子培养液按2
‑
15％接种量接入尿嘧啶营养缺陷型液体培养基中，25～30℃，180
‑
220rpm条件下培养12
‑
24h，即得。
[0023]进一步地，每1L尿嘧啶营养缺陷型固体培养基为：酵母氮源基础6.5
‑
7g/L，灭菌结束后加入尿嘧啶缺陷型氨基酸混合物(DO Supplement
–
Ura)0.72
‑
0.84g/L和葡萄糖1.7
‑
2.3％，琼脂2
‑
3％，用ddH2O定容至1L；
[0024]每1L尿嘧啶营养缺陷型液体培养基为：酵母氮源基础6.5
‑
7g/L，灭菌结束后加入尿嘧啶缺陷型氨基酸混合物(DO Supplement
–
Ura)0.72
‑
0.84g/L和葡萄糖1.7
‑
2.3％，用ddH2O定容至1L；
[0025]其中，上述百分数均为质量浓度百分数。
[0026]一种如上所述的高产磷脂酰丝氨酸的酿酒酵母工程菌株的细胞内的磷脂酰丝氨酸含量测定的方法，具体步骤如下：
[0027](1)酿酒酵母工程菌株发酵结束后，收集全部菌体；
[0028](2)将收集到的菌体进行冷冻干燥、破碎；
[0029](3)使用有机溶剂萃取，合并溶剂层；
[0030](4)使用有机溶剂萃取多次，合并溶剂层；
[0031](5)氮气吹干有机溶剂层，并复溶提取物质；
[0032](6)使用UPLC/MS对所得到的物质进行检测；
...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一株高产磷脂酰丝氨酸的酿酒酵母工程菌株，其特征在于：所述酿酒酵母工程菌株是在酿酒酵母宿主菌中过表达SEQ ID NO.1所示的YML115C基因所得，YML115C基因所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。2.根据权利要求1所述的高产磷脂酰丝氨酸的酿酒酵母工程菌株，其特征在于：所述工程菌株在构建时采用表达载体pRS426，过表达SEQ ID NO.1所示的YML115C基因；其中，所述酿酒酵母宿主菌为酿酒酵母菌株Saccharomyces cerevisiae BY4743。3.如权利要求1或2所述的高产磷脂酰丝氨酸的酿酒酵母工程菌株的构建方法，其特征在于：所述方法包括以下步骤：在酿酒酵母菌株Saccharomyces cerevisiae BY4743中过表达SEQ ID NO.1所示的YML115C基因。4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：具体步骤如下：(1)根据SEQ ID NO.1所示的YML115C基因的核苷酸序列设计引物，构建带有myc
‑
HA标签的YML115C基因过表达的重组质粒；(2)对步骤(1)构建的重组质粒采用醋酸锂转化法导入酿酒酵母菌株Saccharomyces cerevisiae BY4743中进行表达；(3)在尿嘧啶营养缺陷型固体培养基上进行筛选，在尿嘧啶营养缺陷型固体培养基上生长出的单菌落，即为高产磷脂酰丝氨酸的酿酒酵母工程菌株。5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于：每1L尿嘧啶营养缺陷型固体培养基为：酵母氮源基础6.5
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7g/L，灭菌结束后加入尿嘧啶缺陷型氨基酸混合物0.72
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0.84g/L和葡萄糖1.7
‑
2.3％，琼脂2
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3％，用ddH2O定容至1L；其中，上述百分数均为质量浓度百分数。6.如权利要求1或2所述的高产磷脂酰丝氨酸的酿酒酵母工程菌株在磷脂酰丝氨酸生产中的应用。7.利用如权利要求1或2所述的酿酒酵母工程菌株发酵生产磷脂酰丝氨酸的方法，其特征在于：步骤如下：将高产磷脂酰丝氨酸的酿酒酵母工程菌株通过三区划线涂布于尿嘧啶营养缺陷型固体培养基平板上，25～30℃培养48
‑
72h，将活化后的菌种，接1
‑
2环于装有3
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5mL尿嘧啶营养缺陷型液体培养基中，25～30℃，180
‑
220rpm条件下培养12
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【专利技术属性】
技术研发人员：王敏，屠琳娜，杨春燕，喻雅琪，夏梦雷，申雁冰，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：
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