蛋白免疫印迹实验中两种抗体同时标记的方法技术

本发明专利技术公开了蛋白免疫印迹实验中两种抗体同时标记的方法，包括蛋白定量、聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、封闭、抗体标记、显影等步骤。该方法能在同一时间标记两种抗体，在一块ＰＶＤＦ膜同时标记抗人硫氧还蛋白抗体和抗人ｂｅｔａ－ａｃｔｉｎ抗体。本发明专利技术抗体标记方法的两种抗体互不影响，利用这两种抗体可以一次性标记同一块ＰＶＤＦ膜，显影后条带清晰，且提高了效率，减少了剥膜中的操作误差，增加了其可比性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于蛋白免疫印迹实验，具体地，涉及蛋白免疫印迹实验中两种抗体同时标记的方法，进一步涉及抗人硫氧还蛋白抗体和抗人beta-actin蛋白抗体两种蛋白抗体在蛋白免疫印迹实验中同时标记的方法。
技术介绍
蛋白免疫印迹法(Western Blotting)是利用抗体和抗原怜性，检测细胞或组织 中某一蛋白表达的常用方法。现有技术中蛋白免疫印迹法一般的步骤为首先是将所提取的蛋白定量后进行 聚丙烯凝胶电泳(SDS-PAGE)，然后转膜将蛋白转至固体介质如PVDF膜上，再用相应的目的蛋白抗体作为探针进行标记、显影，根据条带变化来判断蛋白表达量的情 况。为了确认蛋白加样量是否均匀，在实验过程中需要有内参(如beta-actin)来指 示，所以在同一块PVDF膜是要标记两个抗体，即标记目的蛋白抗体后还要剥膜， 再标记内参的抗体。此种方法容易产生剥膜中的蛋白的不均匀损失，其可比性较弱。现有技术中没有的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种，利 用两种抗体可以一次性标记同一i央PVDF膜，显影后条带清晰，且提高了效率，减少 了剥膜中的误差，增加了其可比性；具有应用价值。为了实现本专利技术的上述目的，本专利技术提供了如下的技术方案，包括蛋白定量、聚丙烯酰胺凝 胶电泳、转膜、封闭、抗体标记、显影步骤。蛋白定量步骤采用A液与B液以50: 1的比例混合的BCA试剂定量所提取的蛋 白，将蛋白提取液与BCA试剂加于酶标板，37-C30min后测0D562，再根据标准蛋白所做的标准曲线计算出所提取蛋白浓度，根据蛋白浓度来确定电泳时蛋白的加样 聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤采用蛋白定量步骤确定出的蛋白加样量加入蛋白，胶浓度15%，电泳条件180v， 100mA， 35min。转膜步骤用转膜条件100v， 350mA， 75min将蛋白转至PVDF膜。 封闭步骤是转膜结束后，将PVDF膜取出，用7X脱脂奶TPBS液封闭，4"C过夜。 抗体标记是将PVDF膜从脱脂奶中取出，用TPBS洗膜两次，每次5min，标记一种抗体，室温75min，洗膜三次，每次5min后，再标记第二种抗体，室温75min，洗膜三次10min，两次5min后即可显影。其中两种抗体优选两种特异性较好的一次抗体，相互之间没有相同的抗原结合位点。本专利技术旨在提供一种能在同一块PVDF膜上同时+gi己两种蛋白抗体的标记方法。 本方法选用了两种特异性较好的一次抗体(抗人硫氧还蛋白抗体和抗人 beta-actin抗体)，这两种抗体的目的蛋白分子量相差较为显著(硫氧还蛋白为 12KD， beta-act in为42KD)，且这两种抗体之间相互之间没有相同的抗原结合位点， 这两种抗体最好是相同属来源。利用这两种抗体可以一次性标记同一i央PVDF膜，显 影后条带清晰，且提高了效率，减少了录鵬中的误差，增加了其可比性。具有应用 价值。抗人硫氧还蛋白抗体购自Santa cruz公司，分子量12KD;抗人beta-actin蛋 白抗体购自晶美生物公司，分子量42KD。实验组蛋白为不同浓度的三七二醇刺激 MCF7细胞后所提取的蛋白。本专利技术所涉及的抗人硫氧还蛋白抗体和抗人beta-actin蛋白抗体同时标记的 步骤为(1)蛋白定量用BCA试剂(BCA试剂A液与B液以50: 1的比例混合)定量所提4取的蛋白，将蛋白提取液lOul与BCA试剂190ul加于酶标板，37。C30min后测0D562， 再根据标准蛋白所做的标准曲线计算出所提取蛋白浓度。根据蛋白浓度来确定电泳 时蛋白的加样量；(2) 聚丙烯酉划安凝胶电泳胶浓度为15%，蛋白加样量7ug，电泳条件180v， lOOmA， 35min;(3) 转膜转膜条件100v， 350mA， 75min将蛋白转至PVDF膜；(4) 封闭转膜结束后，将PVDF膜取出，用7X脱脂奶TPBS液封闭，4"C过夜；(5) 抗体标记将PVDF膜从脱脂奶中取出，用TPBS洗膜两次，每次5min，标 记一抗(一抗溶液中含有鼠抗人硫氧还蛋白抗体1: 2000和抗人beta-actin抗体1: 10000)，室温75min，洗膜三次，每次5min后，再标记二抗(抗鼠IgG 1: 5000)， 室温75min，洗膜三次10min，两次5min后即可显影；(6) 显影将PVDF膜浸于化学发光底物中，马上在暗室中显影，将结果显示 于胶片。附图说明图1为同时标记抗人硫氧还蛋白抗体和抗人beta-actin抗体后显影结果显不；图2为对比试验标记抗人硫L氧还蛋白抗体后剥膜再标记抗人beta—actin 抗体两次显影结果。 具体实 式下面结合附图，用实施例来进一步说明本专利技术的实质性内容，但并不以此限定 本专利技术。实施例1抗人硫氧还蛋白抗体和抗人beta-actin蛋白抗体同时标记方法 (1)蛋白定量用BCA蛋白定量试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司，BCA试 剂A液与B液以50: 1的比例混合)定量所提取的蛋白，将蛋白提取液lOul与BCA试剂混合液190ul加于酶标板，37度孵育30min后测0D562，再根据标准蛋白所做的标准曲线计算出所提取蛋白浓度。根据蛋白浓度来确定电泳时蛋白的加样量；(2) 聚丙烯酉划安凝胶电泳胶浓度为15%(分离胶含聚丙烯酰胺和甲叉双丙稀酰 胺混合物15%， Tris 37. 5mMpH8. 8，十二烷基磺酸钠0. 1%，过硫酸铵0. 1%， TE鹿D 0.04%)，根据步骤(1)确定的蛋白加样量加入蛋白7ug，电泳条件180v， lOOmA， 35min(电泳液含Tris25mM,甘氨酸200mM，十二烷基磺酸钠1%);(3) 转膜转膜条件100v， 350raA， 75min(转膜液含Tris25mM，甘氨酸200mM， 甲醇20%)将蛋白转至PVDF膜；(4) 封闭转膜结束后，将PVDF膜取出，用7X脱脂奶TPBS液(TPBS液含氯 化钠137mM，氯化钾2.7mM，磷酸氢二钠8mM，磷酸二氢钾1. 5mM，吐温20 0.1%) 封闭，4度过夜；(5) 抗体标记将PVDF膜从脱脂奶中取出，用TPBS液洗膜两次5min，标记一 抗(一抗溶液中含有抗人硫氧还蛋白抗体1: 2000和抗人beta-actin抗体1: 10000， TPBS液配制)，室温75min， TPBS液洗膜三次5min后再标记二抗(抗鼠IgG 1: 5000， TPBS液配制)，室温75min， TPBS液洗膜三次10min，两次5min后即可显影；(6) 显影加化学发光底物于PVDF膜上，马上在暗室中显影，将结果显示于, 胶片。实施例2对比试验抗人硫氧还蛋白抗体和抗人beta-actin蛋白抗体两种抗 体分标记的方法(1) 蛋白定量用BCA蛋白定量试剂盒(北京普利莱基因技术有限公司，BCA试 剂A液与B液以50: 1的比例混合)定量所提取的蛋白，将蛋白提取液10ul与BCA 试剂混合液190ul加于酶标板，37度孵育30min后测OD562，再根据标准蛋白所做 的标准曲线计算出所提取蛋白浓度。根据蛋白浓度来确定电泳时蛋白的加样量；(2) 聚丙烯醐安凝胶电泳胶浓度为15%(分离胶含聚丙烯醐安和甲叉双丙稀酰6胺混合物15%， Tris 37. 5mM pH8. 8，十二烷基磺酸钠0.1 本文档来自技高网...

【技术保护点】
蛋白免疫印迹实验中两种抗体同时标记的方法，其特征在于包括蛋白定量、聚丙烯酰胺凝胶电泳、转膜、封闭、抗体标记、显影步骤。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：白洁，王晟东，刘晓慧，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：53[中国|云南]