诊断乳腺癌的分子标记物制造技术

本发明专利技术公开一种诊断乳腺癌的分子标记物，检测乳房正常周边组织与包块组织中的硫氧还蛋白（ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ，ＴＲＸ）和硫氧还蛋白结合蛋２（ＴＲＸ－ｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ－２，ＴＢＰ－２）的表达。采用蛋白免疫印迹实验检测硫氧还蛋白、硫氧还蛋白结合蛋白２的表达量，在乳腺包块组织中硫氧还蛋白表达增高和硫氧还蛋白结合蛋白２表达降低，由于与正常乳腺组织存在显著的差别，硫氧还蛋白和硫氧还蛋白结合蛋白２可以作为乳腺癌新的分子标记物，可用作为对乳腺癌临床诊断。

【技术实现步骤摘要】
诊断5U^IS的肝蹄物駄领域本专利技术属于生物S7lt领域，具体地，涉及一种诊断学L^癌的蛋白质免疫印^ 法，及硫氧还蛋白和硫氧还蛋白结合蛋白2用作检测孚LH癌的蛋白质肝杏琉，在 诊断季IS癌的临床中的鹏。 背景駄学li泉癌是危害女性健康的主要疾病之一，全世界每年约有一百多万妇女患有乳 腺癌。男性也可患乳腺癌，但男性患乳腺癌的机率比女性要d^ 100倍。乳腺癌的^期多数在40-60岁，其发生原因j^E定论， 一般y、为与性激素的变化有关，并具有一定的家族性。早期乳腺癌可无任何自觉^Jl尺，病变晚期可出现学Ui肿块，肿^M地硬韧，边界不，晰，无，感，mt移动性小，多数无明显欺甬。到目前 为止，已有—些基因异常鋭被确定与乳腺癌发生发展有关，但被确定的乳腺癌相 关基因在享,中的异常农达率并不高，乳腺癌早期诊断率仍有f娥高。此外，传统的乳腺癌手术加化疗以舰年来ii合^ffl的多种基因治疗方M后效果较差，没 有显著提高孚IB癌患者的生存率，因而寻找新的孚U^癌^l遵因尤其是乳腺癌异常表达基因对于探讨学u^癌的发病机制具wm要意义，迫切需要寻找新的在乳腺癌中^&变itM著的基因或蛋白。硫氧还蛋白(thioredoxin ， TRX)又称白细胞賴-1样细胞因子、成人T细胞白血病演化因子、早孕因^。人硫舰蛋白是由104个tcs^a^的肝量为 12kDa的多肽。硫氧还蛋白^a胞增殖、生存及抑制凋亡iffi中起着ra的调节作用。作为一种生长因子，硫氧还蛋白可以鹏巴细胞、肝细胞、成纤鄉胞以及许 多癌细J^分泌，并且诱导其自身生长。对一系列AH劍中瘤研究结mM示，将肿 瘤组织与正常组织湘比，肿瘤li^中硫^蛋白a^^，其^feK平和细胞增殖 SM著正相关。硫氧还蛋白结合蛋白2 (TRX-binding protein-2， TBP-2)又称为维生素D:,上调 蛋白l (vitamin D3 up-regulated protein 1, VDUP1)，分子量约为46 kDa。硫氧 还蛋白结合蛋白2广泛分布在动物的多种组织中包括肾上腺、心脏、肺组织、胸 腺、脾脏、睾丸、骨骼肌、肾脏、肝脏、乳腺、卵巢等，其中它在肺组织中的表达 量相对较高，而在脑组织和肝脏组织中的表达量相对较低。硫氧还蛋白结合蛋白2 可以与硫氧还蛋白相互作用。在一些肿瘤组织中，硫氧还蛋白结合蛋白2表达缺失， 若将硫氧还蛋白结合蛋白2转染到癌细胞中，过表达的硫氧还蛋白结合蛋白2抑制细 胞生长，促使细胞凋亡。硫氧还蛋白结合蛋白2还抑制细胞周期，使细胞周期滞留 在G0期，这表明硫氧还蛋白结合蛋白2与肿瘤生长密切相关。因此，硫氧还蛋白和硫氧还蛋白结合蛋白2是研究乳腺癌新的靶位点。但是到 目前为止，现有技术中未见硫氧还蛋白和硫氧还蛋白结合蛋白2与乳腺癌的相关性 的报道。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种诊断乳腺癌分子标记物。本申请找到了一种在乳腺癌包块 组织和正常周边组织中存在差异表达的蛋白质。免疫印迹实验证实，硫氧还蛋白和 硫氧还蛋白结合蛋白2的确在乳腺癌包块组织和正常周边组织中存在明显差异表 达。基于硫氧还蛋白和硫氧还蛋白结合蛋白2与乳腺癌的这种相关性，以这两种蛋 白作为一个蛋白分子标记对其表达量进行检测可以用于检测乳腺癌。本专利技术的目的在于提供一种体外检测乳腺细胞中硫氧还蛋白和硫氧还蛋白结 合蛋白2的表达是否异常的方法；因此，本专利技术的另一目的在于提供一种硫氧还蛋白和硫氧还蛋白结合蛋白2用 作检测乳腺癌的蛋白质分子标记的应用。鉴于到目前为止，还没有硫氧还蛋白和硫氧还蛋白结合蛋白2与乳腺癌的相关 性的报道，因此，本专利技术的这一发现将为乳腺癌的诊断和/或治疗提供一条新的辅4助途径。为了实现本专利技术的上述目的，本专利技术提供了如下的技术方案诊断乳腺癌的方法，包括从样品中获得乳腺包块组织和正常周边组织样品，测 定和比较样品中硫氧还蛋白和硫氧还蛋白结合蛋白2的表达量。 其中蛋白的表达水平通过蛋白免疫印迹法测定。其中当硫氧还蛋白表达水平高于、硫氧还蛋白结合蛋白2表达水平低于正常乳 房组织的表达水平时，判断为乳腺癌。比较包块组织与正常周边组织中硫氧还蛋白和硫氧还蛋白结合蛋白2的表达是用比较用特异性抗硫氧还蛋白/硫氧还蛋白结合蛋白2的抗体检测得到的包块组织 中硫氧还蛋白、硫氧还蛋白结合蛋白2的表达量与正常周边组织该两种蛋白量进行比较，如测得的包块组织硫氧还蛋白表达量高于正常周边组织，硫氧还蛋白结合蛋白2表达量低于正常周边组织时，诊断为乳腺癌。 该方纟跑括以下步骤用特异性抗硫氧还蛋白/硫氧还蛋白结合蛋白2的抗体检测待测乳腺细胞中硫氧还蛋白和硫氧还蛋白结合蛋白2的表达量；将步骤A测得的硫氧还蛋白和硫氧还蛋白结合蛋白2表达量与正常乳腺组织中 硫氧还蛋白和硫氧还蛋白结合蛋白2表达量进行比较，如测得的硫氧还蛋白表达量 高于正常值，硫氧还蛋白结合蛋白2皿量低于正常值，则表示被检测组织中硫氧 还蛋白和硫氧还蛋白结合蛋白2的表达异常。本专利技术的方法用于诊断乳腺癌。附图说明图1为硫氧还蛋白在乳腺癌正常周边组织和包i央组织的免疫印迹分析结果示意 图，显示硫氧还蛋白在乳腺癌患者的包块组织中表达明显上调；图2为硫氧还蛋白结合蛋白2在乳腺癌正常周边组织和包块组织的免疫印迹分析结果示意图，显示硫氧还蛋白结合蛋白2在乳腺癌患者的包块组织中表达明显下 调。具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本 专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实施中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件、实验手册或者制 造商所建议的条件。本实施例所有包块组织和正常周边组织样品均取自同一乳腺癌患者的成对样 品，30例样品年龄在28 71岁。实施例1:乳腺癌正常周边组织及包i央组织蛋白质样品的制备乳腺组织样品均来自云南省昆明医学院附属第一医院，所有肿瘤都己得到病 理确诊。乳腺癌正常周边组织和包块组织蛋白质样品制备方法，具体如下1、 手术切除的新鲜组织i央保存于-8(TC冰箱。2、 制备蛋白质时，切取5 ^t左右的组织块，在冰上用石开磨器研磨成细胞沉 淀，加入120微升细胞裂解液(氯化钠、NP-40、 Tris、 PMSF、 aprotimin、 NaN3/100 毫升)，置于冰上作用50射中，之后12000r/min， 4"C离心15分钟，取上清保存于 -80。C冰箱。实施例2:硫氧还蛋白和硫氧还蛋白结合蛋白2蛋白免疫印迹法验证 为确认硫氧还蛋白和硫氧还蛋白结合蛋白2的差异表达，取30例乳腺癌患者 的包i组织及相应正常周边组织蛋白质样品，用分别抗硫氧还蛋白、硫氧还蛋白结合蛋白2的抗体进行免疫印迹分析，具体过程简述如下每例样品取7ug蛋白质总上样量，用15%SDS-PAGE分离，转移质PVDF膜(购 自Millipore公司)上，脱脂奶4。C孵育PVDF膜过夜。用TPBS洗涤三次，每次5分钟。 一抗使用小鼠抗人硫氧还蛋白抗体(日本京都大学淀井溶司教授提供)， 室温下孵育1小时，用TPBS洗涤三次，每次5分钟。二抗抗小鼠(affinity purified antibody peroxidase labled goat anti-mouse lgG(H+U HSA liquid conjugate, 购自本文档来自技高网...

【技术保护点】
诊断乳腺癌的分子标记物，该方法包括从样品中获得乳腺包块组织和正常周边组织样品，测定和比较样品中硫氧还蛋白和硫氧还蛋白结合蛋白２的表达量。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：白洁，党英男，蒋爱梅，李彦辉，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：53[中国|云南]