含有表达安第斯病毒(ANDV)蛋白的修饰的BCG菌株的、可用于预防和治疗汉坦-安第斯病毒感染的免疫原性制剂制造技术

本发明专利技术涉及一种免疫原性制剂，所述免疫原性制剂在药学上可接受的盐缓冲溶液中以104

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】含有表达安第斯病毒(ANDV)蛋白的修饰的BCG菌株的、可用于预防和治疗汉坦
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安第斯病毒感染的免疫原性制剂


[0001]报告了一种用于制备针对安第斯病毒(Andesvirus)(ANDV)的疫苗的免疫原性制剂，其中该制剂包括至少一种减毒的牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)卡介菌(Bacillus Calmette
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Gu
é
rin，BCG)菌株，其重组地表达一种或多种ANDV的蛋白或免疫原性片段。

技术介绍

[0002]汉坦病毒是人类两种疾病的病原因子：肾综合征出血热(HFRS)和汉坦病毒心肺综合征(HCPS)。这些分布在世界各地的病毒被归类为导致HFRS的旧世界汉坦病毒，在欧洲和亚洲的主要物种：汉坦病毒(HTNV)和汉城病毒(Seoul virus)(SEOV)等。另一方面，新世界的汉坦病毒造成HCPS并且包括36个物种，它们其中：分布在美洲的安第斯病毒(ANDV)、辛诺柏病毒(Sin nombre)(SNV)和埃可(Choclo)病毒(CHOV)。
[0003]物种ANDV是美洲特有的，与其他汉坦病毒相比具有高毒力，到目前为止，它是唯一能够在人与人之间传播的物种。值得一提的是，针对旧世界汉坦病毒物种的疫苗开发处于领先地位，然而，这些疫苗并不能针对新世界物种提供保护。
[0004]ANDV是一种反义或负链RNA病毒，在其基因组中包括编码核衣壳蛋白(N)的小片段(S)，编码源自糖蛋白Gn和Gc的前体糖蛋白的中片段(M)，以及编码RNA依赖性聚合酶的大片段(L)。
[0005]目前，还没有能够在宿主中产生针对ANDV感染的免疫记忆的预防性治疗。
[0006]在技术现状中，我们发现了一些公开或保护针对ANDV的疫苗的文件，其中为WO2019178286A1、CL201802306和CL201101085，其中所有这些文件都使用ANDV的包膜糖蛋白Gn和Gc作为免疫原性颗粒。这些蛋白是最明显的疫苗靶标，因为在衣壳中被认为更容易被宿主的免疫系统识别。另一方面，D.M.Custer et al.(Journal of Virology,2003,vol.77,no 18,p.9894
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9905)披露了包括ANDV的基因组片段M的DNA疫苗，如前所述，它也编码Gn和Gc。虽然这种策略很有前途，但迄今为止，还没有关于在人类宿主中接种外源DNA的立法或卫生许可。
[0007]鉴于这种情况，本专利技术人开发了一种新的疫苗，其策略与其他团体开发的疫苗不同，它主要基于ANDV的N蛋白，而不是Gn和Gc，并且其使用牛分枝杆菌卡介菌(BCG)的减毒菌株作为载体，卡介菌在100多年来已经被证明可以安全用于新生儿，并且已知可以作为佐剂并诱导赋予长期免疫力的应答。令人惊讶的是，本专利技术人表明，通过使用病毒的核衣壳蛋白(N)，产生免疫力，从而允许控制ANDV的感染。
附图说明
[0008]图1.rBCG
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N
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ANDV表达重组N
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ANDV。使用针对N
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ANDV的特异性单克隆抗体作为一抗，然后是与辣根过氧化物酶(HRP)结合的二抗。菌落2和3(C2 FT和C3 FT)对应于菌落裂解物rBCG
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N
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ANDV。还示出了阳性对照(在大肠杆菌(E.coli)中表达的重组N
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ANDV，N
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ANDV)和
ID NO:2具有至少95％同一性。因此，ANDV的N蛋白或其免疫原性片段可以以可溶性胞质方式由BCG表达，分泌至细胞外或作为细胞膜结合的蛋白。所用的BCG菌株优选是在BCG Danish或BCG Pasteur之间选择。
[0016]在本专利技术的一种实施方式中，安第斯病毒的蛋白或免疫原性片段的氨基酸序列对应相对于根据SEQ ID NO:1限定的ANDA的N蛋白的序列具有至少75％、80％、85％、90％、95％或更多的同一性，其中差异包括置换、缺失、添加或插入。同样，对于本领域的专家来说显而易见的是，为了获得这种蛋白的表达，必须用含有编码所述蛋白的核苷酸序列的载体对细菌进行转化，其中本专利技术包括相对于根据SEQ ID NO:2限定的核苷酸序列及其因遗传密码简并而导致的等价物具有至少75％、80％、85％、90％、95％或更多的同一性的核苷酸序列。
[0017]配制时，本专利技术的免疫原性制剂通过冷冻、冻干或盐缓冲液和注射用制剂的赋形剂进行稳定，以在使用前保存。其中合适的赋形剂为：谷氨酸钠、七水硫酸镁、磷酸氢钾、一水柠檬酸、一水L
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天冬酰胺、柠檬酸铁铵、甘油和注射用制剂的水，以及在执行本专利技术时本领域任何其他可用物。
[0018]在本专利技术的另一种实施方式中，保护所述的免疫原性制剂在制备疫苗以预防、治疗或减弱ANDV的感染和汉坦病毒心肺综合征(HCPS)的发展中的用途，其中，所述制剂含有用盐溶液稳定的1x104‑
1x109个CFU(菌落形成单位)的分枝杆菌属BCG重组减毒菌株。这种疫苗可以在生理上可接受的盐水中以皮下、经皮或真皮下给药。
[0019]为了产生本专利技术所保护的制剂，使用了BCG的Danish或Pasteur菌株，并且我们在基因组水平上对其进行转化，在其复制周期期间组成性地表达ANDV的N蛋白。这种蛋白的合成不会对细菌的复制能力产生改变或阻碍，所以它不会对载体菌株产生毒性作用。
[0020]本专利技术的两个特点是强调其安全性特性和免疫原性，我们已经在小鼠临床前模型中对其进行了评估。我们对免疫小鼠的生长曲线和临床表现的结果表明，给药这种疫苗不会产生明显的不良反应，其效果与未转化的BCG或WT(野生型)的效果相似。关于这种疫苗的免疫原性，我们观察到它产生了针对纯化抗原N
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ANDV的CD4+和CD8+特异性T细胞的增殖和活化，这是造成免疫应答和产生免疫记忆的基本刺激。
[0021]对本专利技术的疫苗所观察到的安全性和免疫原性特性使其成为安全的免疫工具。
[0022]目前还没有批准用于预防或治疗ANDV感染的有效疫苗或治疗方法。根据本专利技术，表达ANDV的N蛋白的重组BCG疫苗(rBCG
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N
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ANDV)可以用于所有年龄的个体。本专利技术包括为预防汉坦病毒心肺综合征(HCPS)而开发的疫苗。BCG是开发疫苗的良好运载体，因为它已被显示对新生儿、儿童和成人是安全的。它可以容易地大规模生产，成本低，而且对温度变化稳定。除此之外，BCG还可以作为佐剂，诱导Th1应答(辅助性T淋巴细胞)，这对于消除病毒是必要的。与其他制剂不同，表达病毒蛋白的BCG载体在人类中已被广泛使用了近100年。此外，ANDV的N蛋白在新世界的所有汉坦病毒亚型(36物种)中高度保守，因此这种疫苗可以赋予针对整个美洲的汉坦病毒心肺综合征的发展的保护。
[0023]作为对本专利技术所取得成果的总结，我们可本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.针对汉坦病毒和/或汉坦病毒心肺综合征(HCPS)的发展赋予保护的免疫原性制剂，其特征在于，它包括在药学上可接受的盐缓冲溶液中的每剂的量为104‑
109个CFU之间的分枝杆菌属(Mycobacterium)卡介菌(BCG)的减毒重组菌株，其表达病毒安第斯病毒(ANDV)的至少一种蛋白或免疫原性片段。2.根据权利要求1所述的免疫原性制剂，其特征在于，所述病毒安第斯病毒的蛋白或免疫原性片段对应于ANDV的N蛋白或其免疫原性片段。3.根据权利要求2所述的免疫原性制剂，其特征在于，所述病毒安第斯病毒的蛋白或免疫原性片段对应于与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少75％同一性的氨基酸序列。4.根据权利要求3所述的免疫原性制剂，其特征在于，所述病毒安第斯病毒的免疫原性蛋白或片段与SEQ ID NO:1的序列具有至少95％同一性。5.根据权利要求2所述的免疫原性制剂，其特征在于，编码ANDV的N蛋白或其免疫原性片段的基因以一个或多个拷贝插入分枝杆菌属BCG的基因组中或染色体外质粒中。6.根据权利要求5所述的免疫原性制剂，其特征在于，编码ANDV的N蛋白或其免疫原性片段的基因对应于与SEQ ID NO:2具有至少75％同一性的核苷酸序列。7.根据权利要求6所述的免疫原性制剂，其特征在于，编码ANDV的N蛋白或其免疫原性片段的基因对应于与SEQ ID N...

【专利技术属性】
技术研发人员：亚历克西斯，
申请(专利权)人：智利天主教教皇大学，
类型：发明
国别省市：