用于编辑真核细胞的内源DNA的融合蛋白制造技术

一种用于在靶位点处编辑真核细胞或真核生物体中的内源DNA的蛋白，其包含位点特异性核酸内切酶和5

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于编辑真核细胞的内源DNA的融合蛋白
专利

[0001]本专利技术涉及用于在真核细胞或真核生物体中在内源DNA的靶位点处编辑内源DNA的蛋白(如融合蛋白)以及包含编码该蛋白的多核苷酸的核酸分子。本专利技术还涉及包含所述核酸分子的多核苷酸的DNA构建体、质粒或载体。本专利技术还涉及包含所述蛋白或核酸分子或DNA构建体、质粒或载体的原核或真核细胞。本专利技术还涉及用于在真核细胞或真核生物体中在靶位点处编辑内源DNA的试剂盒。此外，本专利技术涉及一种用于在靶位点处将目标供体序列(donor sequence of interest)插入真核细胞或真核生物体的内源DNA中的方法，以及一种用于在靶位点处修饰真核细胞或真核生物体的内源DNA的方法。还提供了通过所述方法产生的细胞或真核生物体。
[0002]专利技术背景
[0003]通过CRISPR/Cas技术的基因组编辑的最新进展简化了基因和基因组的靶向修饰，并为基因工程创造了新的可能性。位点特异性核酸内切酶如Cas9使得在基因组中诱导靶向修饰相对容易，因为它们可以在指定位点产生双链断裂(DSB)。DSB对本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.蛋白，用于在真核细胞或真核生物体中在内源DNA的靶位点处编辑所述内源DNA，所述蛋白包含位点特异性核酸内切酶和5
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核酸外切酶，其中所述5
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核酸外切酶优选地是单体的5
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核酸外切酶。2.根据权利要求1所述的蛋白，其中5
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核酸外切酶是氨基酸序列为以下或氨基酸序列包含以下的蛋白：A)(i)SEQ ID NO：43(PapE)中定义的氨基酸序列，或(ii)与SEQ ID NO：43中定义的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，或(iii)与SEQ ID NO：43中定义的氨基酸序列具有至少90％序列相似性的氨基酸序列，或(iv)与SEQ ID NO：43中定义的氨基酸序列相比具有1至121个氨基酸取代、添加、插入和/或缺失的氨基酸序列，或B)(i)SEQ ID NO：44(PiE)中定义的氨基酸序列，或(ii)与SEQ ID NO：44中定义的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，或(iii)与SEQ ID NO：44中定义的氨基酸序列具有至少90％序列相似性的氨基酸序列，或(iv)与SEQ ID NO：44中定义的氨基酸序列相比具有1至131个氨基酸取代、添加、插入和/或缺失的氨基酸序列。3.根据权利要求1所述的蛋白，其中所述5
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核酸外切酶是氨基酸序列为以下或氨基酸序列包含以下的蛋白：C)(i)SEQ ID NO：45(ME15)中定义的氨基酸序列，或(ii)与SEQ ID NO：45中定义的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，或(iii)与SEQ ID NO：45中定义的氨基酸序列具有至少90％序列相似性的氨基酸序列，或(iv)与SEQ ID NO：45中定义的氨基酸序列相比具有1至60个氨基酸取代、添加、插入和/或缺失的氨基酸序列；或D)(i)SEQ ID NO：46(SpiPh)中定义的氨基酸序列，或(ii)与SEQ ID NO：46中定义的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，或(iii)与SEQ ID NO：46中定义的氨基酸序列具有至少90％序列相似性的氨基酸序列，或(iv)与SEQ ID NO：46中定义的氨基酸序列相比具有1至59个氨基酸取代、添加、插入和/或缺失的氨基酸序列。4.根据权利要求1至3中任一项所述的蛋白，其中所述蛋白是包含所述位点特异性核酸内切酶和所述5
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核酸外切酶的融合蛋白。5.根据权利要求1至3中任一项所述的蛋白，其中所述蛋白是包含第一蛋白亚基和第二蛋白亚基的寡聚蛋白(蛋白复合物)，所述第一蛋白亚基包含所述位点特异性核酸内切酶，
所述第二蛋白亚基包含所述5
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核酸外切酶。6.根据权利要求5所述的蛋白，其中所述第一蛋白亚基包含(优选地作为所述第一蛋白亚基的结构域的)所述位点特异性核酸内切酶和第一相互作用结构域，所述第二蛋白亚基包含(优选地作为所述第二蛋白亚基的结构域的)所述5
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核酸外切酶和第二相互作用结构域，其中所述第一相互作用结构域和所述第二相互作用结构域彼此结合以形成所述寡聚蛋白(蛋白复合物)。7.根据权利要求1至3中任一项所述的蛋白，其中所述蛋白是包含第一蛋白亚基和第二蛋白亚基和核酸(如gRNA)和适体的寡聚蛋白，所述第一亚基包含所述核酸内切酶，所述第二亚基包含所述5
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核酸外切酶，所述核酸具有能够结合所述核酸内切酶的部分，所述适体能够结合所述5
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核酸外切酶。8.根据权利要求1至7中任一项所述的蛋白，其中所述位点特异性核酸内切酶是能够诱导DNA双链断裂或DNA内的双链断裂的CRISPR核酸酶，例如Cas9或Cas12a，或是能够诱导双链DNA的单链切口的具有切口酶活性的CRISPR核酸酶，例如Cas9的切口酶变体。9.蛋白，用于在真核细胞或真核生物体中在内源DNA的靶位点处编辑所述内源DNA，其包含位点特异性核酸内切酶和5
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核酸外切酶，其中所述位点特异性核酸内切酶是如权利要求8中所定义的CRISPR核酸酶，和其中所述位点特异性核酸内切酶和所述5
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核酸外切酶通过多肽接头融合，所述多肽接头具有25个氨基酸残基或更多，优选30个氨基酸残基或更多的长度，和其中所述5
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核酸外切酶是氨基酸序列为以下或氨基酸序列包含以下的蛋白：(i)SEQ ID NO：32(UL12
‑
1)或SEQ ID NO：33(UL12
‑
2)中定义的氨基酸序列，或(ii)与SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：33中定义的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列，或(iii)与SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：33中定义的氨基酸序列具有至少90％序列相似性的氨基酸序列，或(iv)与SEQ ID NO：32或SEQ ID NO：33中定义的氨基酸序列相比具有1至120个氨基酸取代、添加、插入和/或缺失的氨基酸序列。10.根据权利要求1至9中任一项所述的蛋白，其中所述5
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核酸外切酶：在说明书中所述的体外核酸外切酶测定中，在催化效率k
cat
/K
m
或转换数方面，与T7核酸外切酶(SEQ ID NO：30)相比具有相同或更高的5
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核酸外切酶活性；或在说明书中所述的体外核酸外切酶测定中，在催化效率k
cat
/K
m
或在转换数方面，具有至少两倍于T5核酸外切酶(SEQ ID NO：31)的5
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核酸外切酶活性。11.根据权利要求1至10中任一项所述的蛋白，其中，与当提供供体核酸时所述蛋白的所述位点特异性核酸内切酶和所述5
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核酸外切酶没有相融合或没有形成蛋白复合物时的单独应用相比，所述蛋白提供了增加的通过同源介导修复(HDR)途径的双链断裂修复的频率和/或更高的基因靶向或基因置换事件的频率。12.根据权利要求1、2或4至11中任一项所述的蛋白，其中所述5
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核酸外切酶的氨基酸序列包含SEQ ID NO：56(PXPLMXFXEAATQXQXXXQLWXLLRRGLXTAXTLXWGXXGPXFXXXWL XXXXXXXXXXXXXAXXFGRXNEXXARXXLFRYCVGRAD)的氨基酸序列区段。13.根据权利要求1、2或4至11中任一项所述的蛋白，其中所述5
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核酸外切酶的氨基
酸序列包含SEQ ID NO：54(FRYCVGRAD)和SEQ ID NO：55(PXPLMXFFEAATQ)的氨基酸序列区段。14.根据权利要求4和8至13中任一项所述的蛋白，其中所述5
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核酸外切酶融合至所述位点特异性核酸内切酶的N
‑
末端或C
‑
末端。15.根据权利要求4、8和10至14中任一项所述的蛋白，其中所述位点特异性核酸内切酶和所述5
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核酸外切酶通过多肽接头融合。16.根据权利要求15所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：S，
申请(专利权)人：莱布尼茨植物生化研究所，
类型：发明
国别省市：